金不换对药物性肝损伤的保护和与雪上一枝蒿配伍协同抗炎作用研究

发布时间：2020-06-01 10:40

【摘要】：金不换为药用植物Veratrilla baillonii Franch的干燥根,其味苦性寒,清热解毒。能用于肺热咳嗽、痢疾、烧伤等。其主要化学成分为(裂)环烯醚萜苷类和Tk咕酮类,其中环烯醚萜苷类具有保肝、抗炎、镇痛等功效。雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook F.)系卫矛科(Celastraeeae)雷公藤属(Tripterygium)一年生藤本植物,药性辛、凉,味苦,有大毒,归肝、肾经,具有祛风除湿,活血通络,消肿止痛,杀虫解毒,但有大毒,限制了其临床应用。毛茛科乌头属药材雪上一枝蒿(Aconitum brachypodum Diel)常被云南当地人民用于治疗疼痛和炎症相关的疾病。本实验室前期表明金不换能解由乌头类引起的中毒,并且基因芯片结果表明金不换与雪上一枝蒿配伍可能具有协同抗炎作用。故本文一方面从雷公藤诱导的药物性肝损伤来了解金不换的保肝解毒作用,另一方面研究金不换与雪上一枝蒿配伍的协同抗炎作用。1.金不换保肝实验体内实验以小鼠为研究对象,灌胃给药金不换水提物(WVBF)(0,25,50,100 mg/kg)7天后,再灌胃给药雷公藤多苷(TG)片270 mg/kg 4天,以体重变化,血液生化指标,病理切片,MicroRNA-122(miR-122)的表达量以及代谢酶的改变来评价WVBF对TG致小鼠肝毒性的解救作用;体外实验以HepG2细胞为研究对象,采用MTT法研究不同浓度的雷公藤甲素(TP)对HepG2细胞存活率的影响,选择20 nM的TP为致毒模型,研究金不换水提物中6个单体与TP合用对HepG2细胞存活率的影响,12.5μM、25μM、50μM三个浓度的龙胆苦苷为解药组,2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)含量,JC-1检测线粒体膜电位(△Ψm)变化,并用实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测肝药酶CYP3A4/1A2和线粒体DNA(mtDNA)表达量变化。由体内实验结果可知,雷公藤多苷片使小鼠的肝组织发生了明显异常病变,显著增加小鼠血液中ALT、AST、ALP、LDH含量,升高肝脏中MDA含量和降低了GSH、SOD的含量,并且抑制了MicroRNA-122的表达;金不换可以缓解雷公藤多苷片所导致的肝功能及氧化应激相关指标的紊乱。由体外实验结果可知,12.5μM、25μM、50μM龙胆苦苷孵育24 h能减弱TP所致的HepG2细胞mtDNA表达量下降、线粒体膜电位损伤。12.5μM、25μM、50μM龙胆苦苷孵育24 h能缓解雷公藤甲素所致的HepG2细胞氧化应激损伤。2.金不换与雪上一枝蒿协同抗炎作用采用LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型探讨雪上一枝蒿总生物碱(CFA)与WVBF之间的协同抗炎作用,利用中效原理法,判断雪上一枝蒿醇提物与金不换协同作用的配伍最佳比例,采用qPCR方法检测iNOS,TNF-α,COX-2和IL-6mRNA表达的变化,DCFH-DA荧光探针标记巨噬细胞检测胞内ROS水平,用荧光探针Fluo-3/AM标记细胞,应用流式细胞仪检测胞内Ca~(2+)水平。结果显示CFA、WVBF、CFA与WVBF配伍比例为1:2、1:5、1:10组,能够显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO产生,但是只有CFA:WVBF=1:10配伍比例下,各种浓度混合物相互作用指数均小于1,表现为协同抗炎作用;CFA单独组、WVBF单独组、CFA:WVBF=1:10配伍组对iNOS,TNF-α,COX-2,IL-6基因表达均有显著性抑制作用,配伍组对iNOS基因抑制作用明显优于CFA组和WVBF组,而对COX-2、IL-6和TNF-α基因表达的抑制效果相对较弱。CFA、WVBF和配伍组均能减少LPS诱导的细胞内活性氧释放增加和胞内Ca~(2+)浓度升高,且配伍组抑制作用强于单药组。结论:(1)WVBF可以通过抑制TG诱导的MicroRNA-122的表达上调、血清生化指标(ALT、AST、ALP、LDH)和MDA升高和上调TG所致的GSH、SOD含量下降来保护TG引起的小鼠肝功能紊乱。(2)WVBF中主要活性成分龙胆苦苷能通过上调TP诱导的mtDNA表达减少、线粒体膜电位丢失和减少细胞内ROS释放来减弱TP诱导的肝细胞毒性。(3)CFA与WVBF=1:10为最佳配伍比例,且通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞内iNOS基因表达、细胞内ROS释放增多和Ca~(2+)浓度升高发挥协同抗炎作用。
【图文】：

HPLC图谱,雷公藤甲素,有毒成分,高效液相色谱法测定

0.13％，0.99％。2.2 实验方法2.2.1 雷公藤多苷片中雷公藤甲素的鉴定TG 中主要的活性成分和有毒成分为 TP，所以我们通过高效液相色谱法测定了 TG 中 TP 的含量。用乙酸乙酯萃取 TG，分离纯化后用于 HPLC。色谱柱为Wondasil C18-WR（250 mm×4.6 mm，，5 μm，日本），流动相由乙腈（A）和水（B）组成，梯度程序为：0~15 min，25%~32%A，15~35 min，32~42%A，35~56min，42~85%A，流速为 1 mL/min。检测波长为 218 nm。通过比较其保留时间和测量标准物质的含量（图 a 和 b）来鉴定 TP。

切片染色,炎性浸润,细胞变性,组织发生

0.05 compared with control; # P < 0.05, ## P < 0.01 compared with TG ).2.3.2 病理切片结果从图 2.3 可以看出，TG 处理 7 天后，组织学上观察到肝脏出现不同程度理病变（箭头所指）。如图 2.3B 所示，TG 组的小鼠肝组织发生了病变，包括细胞的中度水肿，炎性浸润，细胞变性和坏死。WVBF 治疗（25-100 mg / kg后，所有的病理损伤在一定程度上出现缓解（图 2.3 C-E）。
【学位授予单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】