富含花青素植物的筛选及改善动脉粥样硬化的作用机制研究

发布时间：2020-06-01 10:37

【摘要】：花青素是一种天然水溶性色素,广泛存在于有色植物中。花青素具有极强的抗氧化、抗衰老、抗炎抑菌、保护肝脏和视力等作用。随着农业与生物技术的发展,出现了越来越多的富含花青素植物,这些植物中花青素的结构类型、含量分布与所显示的生物活性不完全相同。此外,近年来,心脑血管疾病的发病率越来越高,严重威胁着人类健康,而动脉粥样硬化是心脑血管疾病的病理基础。因此,寻找天然产物来有效缓解动脉粥样硬化(AS),对降低心脑血管疾病的发病率至关重要。本文选取了15种富含花青素的植物,对花青素的提取纯化工艺进行优化,并对花青素纯化物中花青素的含量、抗氧化活性及稳定性进行测定与评价,研究黑枸杞花青素纯化物改善动脉粥样硬化的作用及机制。实验结果如下:1.花青素提取纯化工艺优选利用紫胡萝卜为代表,通过设计正交试验考察,优选出花青素的最佳提取纯化工艺为:以pH为2的50%乙醇溶液为溶剂,按料液比为1:4加入植物材料中进行组织破碎提取1.5min,抽滤,将滤渣再加入料液比为1:2的pH为2的50%乙醇溶液室温超声提取40min,提取1次。抽滤,将滤液合并,在40℃下闪蒸浓缩至原体积的1/5,得到浓缩液。将浓缩液通过Diaion HP2 MGL大孔树脂柱色谱进行富集纯化,先用去离子水洗脱除去水溶性杂质,然后改用pH为3的60%的乙醇溶液,以0.6mL/min的流速进行洗脱,收集深色色带洗脱液,在40℃下闪蒸浓缩结合旋蒸浓缩至干,得到总花青素纯化物干粉,即花青素纯化物。2.15种植物花青素纯化物性能评价利用优化的提取纯化工艺对15种植物进行花青素纯化物的制备,采用pH示差法和HPLC法分别测定各制备物中总花青素的含量和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量。通过实验发现,浆果类植物中花青素的含量要显著高于蔬菜类植物,其中浆果类的黑枸杞花青素纯化物中总花青素的含量相对最高(381.57±7.40mg/g DW)。测定结果还发现仅有8种植物中含有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。采用DPPH、FRAP及TRP 3种方法测定了各制备物的抗氧化活性,并对各制备物在不同的pH值、光照、温度条件下进行稳定性考察和评价,结果发现,黑枸杞花青素纯化物具有极强的清除自由基活性和抗氧化活性,且其水溶液在酸性、低温、避光的条件下稳定性更好。因此,筛选出高花青素含量的黑枸杞作为下一步生物活性研究的对象。3.黑枸杞花青素纯化物改善动脉粥样硬化的作用实验开始给予腹腔注射70万IU/kg·BW的维生素D_3,分4次,隔天给次,同时高脂饲料喂8周构建动脉粥样硬化大鼠模型。造模成功后随机分成6组:正常组(NC;生理盐水)、模型组(AS;生理盐水)、辛伐他汀阳性组(SIM;50mg/kg/d)、低剂量(Low;50mg/kg/d)、中剂量(Mid;100mg/kg/d)、高剂量(Hig;200mg/kg/d)花青素用药组。对所有大鼠灌胃给药治疗6周后,进行血清和组织病理检测发现,经过辛伐他汀药物和黑枸杞花青素纯化物治疗后血清中脂质水平和炎症因子水平都明显得到改善,同时,主动脉内膜泡沫细胞、脂质和钙盐沉积及内膜增厚程度明显减轻;肝脏组织中空泡也明显减少。黑枸杞花青素纯化物明显改善了动脉粥样硬化,且呈现一定的剂量依赖性。4.黑枸杞花青素纯化物改善动脉粥样硬化的机制动脉粥样硬化的发展与肠道菌群紊乱具有紧密联系,且花青素主要在肠道被大量代谢吸收。通过对AS大鼠盲肠内容物16S rDNA测序以及对主动脉、肝脏组织中相关信号通路检测发现:AS大鼠小肠组织遭到破坏,肠道菌群发生了紊乱。黑枸杞花青素纯化物治疗后显著改善了小肠绒毛的完整性,抑制了LPS进入血液,还增加了拟杆菌门、双歧杆菌科、乳酸杆菌科、Akkermansia、Lachnospiraceae_NK4A136_group、罗斯氏菌属的相对丰度,降低了厚壁菌门、肠杆菌科和Prevotellaceae_NK3B31_group的相对丰度,从而抑制了动脉血管炎症通路NF-kB和VCAM-1的表达以及肝脏胆固醇合成蛋白SREBP-2的表达,同时,上调了肝脏胆固醇代谢蛋白CYP7A1的表达,发挥了改善动脉粥样硬化的作用。
【图文】：

花青素,色素,飞燕草,矢车菊素

是种天然水溶性色素，广泛，并随着液泡 pH 变化使其呈现不同的色彩色[1]。花青素的结构是由 C6-C3-C6为骨架黄酮类物质。由于芳香环上连接的取代基种，其中在食品中常见的花青素主要为天竺葵、飞燕草素（Delphinidin）、芍药花色素（P葵色素（Malvidin），其结构如图 1.1 所示[2]的结构被鉴定出来了，大部分由糖苷配基与形成花色苷的形式存在，其中矢车菊素-3-多植物中都存在；而游离形式的花青素极少

高效液相色谱,矢车菊素,葡萄糖苷,高效液相色谱

混匀后过 0.45μm 微孔滤膜，冷藏备用。.2 待测样品溶液的配制精确称取花青素纯化物干粉 10.00mg，用 2%的盐酸甲醇溶液定容至 10mL，再吸.00mL 用 2%的盐酸甲醇溶液稀释定容至 10mL，过滤膜后冷藏备用。.3 色谱条件色谱分析使用 20RBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱（5μm，4.6mm 250mm），色件：流动相 A 为乙腈，B 为 0.1%磷酸；洗脱梯度 0-15 分钟为 5%-20%A；检测 510nm；流速 1.0 mL·min-1；柱温为 30oC；进样体积为 10μL。.4 标准曲线绘制依次准确吸取对照品溶液 2μL、4μL、6μL、8μL、10μL 分别进样，测定峰面积以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量为横坐标（X），峰面积（Y）为纵坐标建立标线：Y=1.89×106X-6080.1，R2= 0.999。表明对照品在 0.346~1.730μg 范围内，线系良好。图 2.1 为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷色谱图，图 2.2 为矢车菊素-3-O-葡萄糖照品的标准曲线图。
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285;R284

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