葛仙汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠TNF-α、iNOS表达的干预及相关实验研究

发布时间：2020-06-01 13:48

【摘要】：目的通过比较灭活大肠杆菌(E.Coli)菌株免疫+乙酸(AA)灌肠、单纯灭活大肠杆菌(E.Coli))免疫、单纯乙酸(AA)灌肠三种不同方法建立的溃疡性结肠炎模型,探讨一种理想的溃疡性结肠炎造模方法;从结肠组织、相关血液指标、血清免疫学指标、结肠组织免疫检测、肝肾功能等方面,对葛仙汤治疗大鼠溃疡性结肠炎的相关机制进行研究,为中医药验方“葛仙汤”治疗溃疡性结肠炎有效性方面提供一定的客观依据。方法1.健康SD雄性大鼠120只,随机均分为4组,第1、2组分别在实验第1、7、14、20D用灭活大肠杆菌菌株悬浊液注射于大鼠足底、腹部、背部皮下及腹腔内,第4组为对照组,以等量生理盐水替代。实验第21d,第1、3组用5%乙酸灌肠。每日观察各组大鼠精神状态、毛色、饮食、大便性状,每周予以称重、检测大鼠大便隐血;分别于乙酸灌肠后第1w、2w、3w每组随机处死10只,断头取血,检测血清中IL-6的变化,处死大鼠,测量结肠长度并称重,肉眼及光镜观察结肠粘膜组织改变,免疫组化检测结肠中TNF-α阳性表达。2.取(E.Coli)菌株免疫+(AA)灌肠法成功造模的SD大鼠40只,按照随机化原则分为葛仙汤高剂量组、中剂量组、低剂量组,对照组。葛仙汤高、中、低剂量组分别予以生药24g/kg、12g/kg、6g/kg灌胃给药。观察各组大鼠精神状态、毛色、饮食、大便性状、体重,检测大鼠大便隐血;灌胃后21D处死上述40只大鼠,检测血清中IL-6、IL-10、白细胞、血小板、SCr、BUN、AST、ALT,测量结肠长度并称重,观察肠壁组织学变化,免疫组化检测结肠TNF-α、i NOS表达。结果1.第1组乙酸灌肠后2D开始出现精神萎靡,反应迟钝,活动减少,扎堆,毛色无华、变脆;大便次数增多,大便变稀,出现粘液血便或脓血便,体重减轻;1-3w结肠溃疡、炎症、增厚,长度缩短,结肠重量增加;结肠粘膜充血、水肿、高度糜烂,有单个或多处溃疡;结肠重度炎症,病变深及粘膜下层、肌层、浆膜层,基底2/3隐窝被破坏,或仅有完整表面上皮;血清IL-6、肠粘膜TNF-α阳性表达积分值明显升高;各指标均与对照组有显著性差异。2.第2组造模完成后1-3w,大鼠精神状态可,活动如常,无明显扎堆,毛色稍无光泽,大便质稍软,未见稀变及粘液便,大便隐血实验(+),无明显体重减轻;结肠重量、长度与对照组无差异;结肠粘膜轻度充血、水肿,轻度糜烂,无溃疡形成;结肠粘膜呈慢性炎症改变,病变局限于粘膜下层,基底1/3隐窝被破坏;血清IL-6稍升高;肠粘膜TNF-α阳性表达积分值增高;以上各观测指标均与对照组无差异。3.第3组造模完成后1w时出现精神萎靡,反应迟钝,活动减少,扎堆,毛色无华、变脆;大便次数增多,大便变稀,出现粘液血便或脓血便,体重减轻;结肠溃疡、炎症、增厚,长度缩短,结肠重量增加;结肠粘膜粘膜充血、水肿、高度糜烂,有单个或多处溃疡;结肠重度炎症,病变深及粘膜下层、肌层、浆膜层,基底2/3隐窝被破坏,或仅有完整表面上皮;血清IL-6、肠粘膜TNF-α阳性表达增高;以上各指标均与对照组有差异。2-3w时体重逐渐增加,大便逐渐变硬,粘液脓血便逐渐消失,隐血(+);结肠长度增长,重量减轻;结肠粘膜充血水肿减轻,溃疡逐渐愈合;病变局限于粘膜下层,基底1/3隐窝被破坏;血清IL-6、肠粘膜TNF-α阳性表达积分值逐渐下降;各组指标3w时与对照组无明显差异。4.葛仙汤各治疗组的大鼠结肠炎症、充血、水肿减轻,病变范围缩小,隐窝破坏减少,结肠粘膜糜烂和溃疡愈合,大便逐渐成形,脓血便减少,体重增加,疾病活动指数高、中、低与对照组有显著性差异,P0.01,高、中、低剂量组之间无差异,P0.05。5.葛仙汤各治疗组血中白细胞、血小板数量减少,高、中、低治疗组与对照组之间均有显著性差异,P0.01,各治疗组对于降低白细胞方面无差异,高剂量组降低血小板与中低剂量组之间均有差异,P0.05。高、低剂量对红细胞数量无明显升高作用,与对照组无差异。中剂量组红细胞数量增高与对照组有差异,但与正常组差异显著。6.葛仙汤各治疗组大鼠血清IL-6含量减少,IL-10的含量增加,高、中、低剂量治疗组与对照组之间均有显著性差异,P0.01,高剂量升高IL-10的含量的作用与中、低剂量组有差异,P0.05;中剂量降低IL-6含量的作用与高、低剂量有差异,P0.05。7.葛仙汤各治疗组大鼠结肠组织中i NOS、TNF-α阳性表达积分值降低,高、中、低剂量组与对照组之间均有显著性差异,P0.01,高、中剂量组与低剂量组之间有差异,P0.05,高、中剂量组之间无差异。8.葛仙汤高、中、低治疗组血清中SCr、BUN、AST、ALT与正常组、对照组之间均差异无统计学意义,P0.05。结论1.灭活大肠杆菌(E.Coli)菌株免疫+乙酸(AA)灌肠免疫复合法建立的溃疡性结肠炎模型,病变更类似人UC,持续时间长,是较理想的造模方法。2.葛仙汤对大鼠溃疡性结肠炎具有减少炎症细胞、血小板数量。抑制炎症因子释放,抗凝血,促进抗炎因子生成等作用。3.葛仙汤能够促进溃疡性结肠炎粘膜的修复。4.葛仙汤对肝肾功能无明显损伤。总之,实验结果说明,葛仙汤通过对炎性细胞、炎症因子、血小板、结肠病理组织改变的影响,对溃疡性结肠炎有一定的治疗作用。
【图文】：

不同时期,隐窝,溃疡形成,粘膜下层

）大鼠结肠组织学损伤评分结肠组织大体表现见图 1，HE 染色，光镜下 2-5。1w 时第 1、3 组粘膜炎症程度较重，病变深及粘膜下层或肌层，偶尔层，基底隐窝部分破坏或全部破坏，上皮部分或全部破坏，第 2 组结肠粘血、水冲，轻度糜烂，无溃疡形成；结肠粘膜轻度炎症，病变局限于粘膜层 1 /3 隐窝被破坏，第 1、3 组与第 2、4 各组之间均有显著性差异( P<0.01),第 4 组之间无差异，P>0.05；2w 时第 1 组粘膜炎症程度基本同前，第 3 组开始愈合，，伴瘢痕形成，第 2 组粘膜充血水肿较前加重，无溃疡形成，第 1、4 组之间有显著性差异，P<0.01，第 2 组与第 4 组之间有差异，P<0.05；组粘膜呈中度或重度炎症，病变深及粘膜下层或肌层，仍有单个或多处陈旧基底隐窝部分破坏，上皮部分破坏，第 2 组粘膜充血水肿明显，无糜烂或轻无溃疡形成，第 3 组溃疡基本愈合，病变局限于粘膜下层，基底 1 /3 隐窝组与第 2、4 组之间均有显著性差异（ P<0.01），第 2、3 组与第 4 组之间无>O.05），结果见表 6。

结肠,光镜,不同时期,图片

1w 时 2w 时 3w 时图 2 第 1 组不同时期结肠 HE 染色图片（1×10 倍光镜下）1w 时 2w 时 3w 时图 3 第 2 组 1、2、3w 时结肠 HE 染色图片（1×10 倍光镜下）
【学位授予单位】：浙江中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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