槐定碱通过激活P53和Hippo信号通路抑制肺癌细胞生长并增强顺铂敏感性

发布时间：2020-06-01 22:31

【摘要】：背景与目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,是全球癌症相关死亡的主要原因。有两种主要的组织学肺癌:非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。NSCLC占病例的80%以上,而SCLC的特征是细胞快速生长和侵袭性转移。基于铂的化疗是肺癌的重要治疗选择。然而,由于耐药性的发展和相当大的不良反应,化疗的治疗效果受到限制。因此,有必要寻找新的策略,尽量减少铂类化疗的上述两个主要缺点,以逆转肺癌对化疗药物的耐药性。槐定碱是一种从苦豆子中提取的喹嗪类生物碱。它具有一系列药理特性,如抗病毒,抗炎,改善心脏功能和抗癌。2005年,中国食品药品监督管理局(CFDA)批准槐定碱注射液治疗恶性滋养细胞肿瘤。最近,越来越多的报道表明槐定碱在许多其他恶性肿瘤中也具有抑制作用。然而,很少有报道研究槐定碱在肺癌中的肿瘤抑制作用及其在临床肺癌治疗中的作用。在本研究中,实验组主要目的是探讨槐定碱的抗肿瘤作用、槐定碱能否提高顺铂的抗肿瘤功效以及槐定碱与顺铂是否对肺癌的治疗具有协同作用。最终证明槐定碱和铂类化疗的联合治疗是一种很有前景的肺癌治疗方法。材料与方法:细胞培养运用了五株肺癌细胞系,NCI-H460,NCI-H1299,A549,NCI-H446和DMS153,将所有细胞系在37℃及含有5%二氧化碳的潮湿培养箱中温育。细胞活力测试使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)以及Microplate Reader(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)在450nm紫外线吸收峰下测量实验样品的吸光度。集落形成实验计数每个平板的菌落数以进行统计学分析。细胞侵袭和迁移实验测定实验细胞在Transwell小室中的侵袭迁移能力。蛋白质印迹实验检测了P53及HIPPO细胞信号通路的核心蛋白组份。此外还运用荧光定量PCR测定了HIPPO细胞信号通路的下游靶基因表达情况。并且运用裸鼠的异种移植实验将处理后的肺癌细胞定植于裸鼠腹膜内,观察瘤体的大小及做进一步免疫组化和免疫印迹实验。研究结果:1、槐定碱在体外抑制肺癌细胞的增殖。通过CCK-8和集落形成实验,测定分析槐定碱对不同类型的人肺癌细胞的细胞增殖的影响。首先,CCK8实验表明,槐定碱或顺铂单一处理组足以抑制细胞的生长,槐定碱和顺铂联合处理表现出更强的细胞生长抑制性能。集落形成测定表明,槐定碱或顺铂的单一处理抑制了细胞集落的发展,并且两种试剂的组合显着减少了克隆形成(*p值0.05,**p值0.01)。2、槐定碱在体外抑制肺癌细胞的侵袭和迁移。将细胞接种到涂有Matrigel的膜上(用于侵袭测定)或transwell室(用于迁移测定)并用槐定碱、顺铂或槐定碱同顺铂处理24小时,结果表明,槐定碱抑制了这四种肺癌细胞的侵袭和迁移。并且用顺铂(1μM)或顺铂与槐定碱联合处理细胞后,结果表明,顺铂和槐定碱共同处理组可有效抑制细胞的侵袭和迁移,进一步证实槐定碱与顺铂在治疗肺癌上具有协同功效。(*p值0.05,**p值0.01)。3、我们还通过蛋白质印迹技术测试了p53信号通路中关键分子MDM2,Puma,P21和p53的表达水平,结果表明MDM2,Puma,P21和p53的这些蛋白在NCI-H460和A549细胞系中都上调了,但在p53缺陷型NCI-H1299细胞系中并没有出现这种情况。并且我们通过半衰期实验监测NCI-H460细胞中蛋白质水平,结果表明,槐定碱大大延长了P53的半衰期,槐定碱稳定了内源性P53蛋白。然后我们经行了体外泛素化实验,结果表明槐定碱通过减少MDM2介导的P53蛋白泛素化以及稳定P53蛋白,激活p53信号通路,最终起肿瘤抑制剂的作用。4、我们通过蛋白质印迹研究了槐定碱对Hippo途径核心组分蛋白质的影响。结果表明,槐定碱增加了NAP-H460和A549细胞中Hippo通路主要的蛋白LATS1/2,MST1/2,P-YAP的表达,同时降低了YAP的表达。通过槐定碱处理,上述细胞系中CTGF蛋白水平下调了,这是Hippo途径激活的结果。然而,对于p53缺陷的NCI-H1299细胞系,槐定碱对Hippo途径组分的表达没有影响。我们还通过定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)测定NCI-H460细胞中一些Hippo途径的mRNA水平及靶基因水平,结果显示,用槐定碱处理后,NCI-H460细胞中CYR61,CDX2,FOXM1,c-myc和VEGF减少。这些发现表明槐定碱可能激活肺癌细胞中的Hippo通路。5、我们通过建立异种移植模型成瘤实验,将荷瘤小鼠随机分为槐定碱组,顺铂组,槐定碱+顺铂组和阴性对照组并定期按分组不同加入相应组别的药物,结果表明,槐定碱+顺铂共处理组比槐定碱或顺铂单一处理组更显着地减缓异种移植肿瘤的生长。与肿瘤生长曲线一致的是,槐定碱+顺铂联合治疗组肿瘤质量和体重的减少比槐定碱或顺铂单一治疗组更显着。并且我们使用异种移植肿瘤经行了WB及IHC实验,结果示,槐定碱处理的肿瘤中P53,MDM2,LATS1,LATS2的蛋白质水平升高,而YAP和CTGF降低。结论:1、槐定碱不仅可以阻止肺癌细胞的增殖,还可以增强肺癌细胞对顺铂的敏感性。2、槐定碱抑制肺癌细胞中转移的相关过程(侵袭和迁移),并在此实验数据的基础上进一步证实槐定碱与顺铂在治疗肺癌具有协同功效。3、槐定碱通过减少MDM2介导的P53泛素化过程以稳定P53蛋白,激活p53信号通路而起到肿瘤抑制剂的作用。4、槐定碱可能激活肺癌细胞中的Hippo通路。
【图文】：

槐定碱,顺铂,细胞增殖

图 1：槐定碱协同顺铂对体外细胞增殖的影响在 NCI-H460，NCI-H1299，A549 和 DMS153 细胞中进行 CCK-8 和集落形成测定。（a）在 12h，24h，48h，72h 和 96h，用槐定碱（20μg/ ml）、顺铂（6μM）和槐定碱（20μg/ ml）+顺铂（6μM）处理后，，经细胞的 CCK-8 测

槐定碱,细胞侵袭,顺铂

图 2：槐定碱协同顺铂对体外细胞侵袭和迁移的影响在 NCI-H460，NCI-H1299，NCI-H446 和 DMS153 细胞中进行 Transwell侵袭和迁移测定。将细胞接种到涂有Matrigel的膜上（用于侵袭测定）或transwell室（用于迁移测定）并用槐定碱（120μg/ ml），顺铂（10μM）和槐定碱（120
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】