烟酸姜黄素酯对低剪切应力诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及机制研究

发布时间：2020-06-02 02:02

【摘要】：目的:探讨烟酸姜黄素酯(Curcumin Nicotinate,CN)对低剪切应力(Low Shear Stress,LSS)诱导人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)凋亡的抑制作用及机制研究。方法:首先采用CCK-8法检测不同浓度CN处理HUVECs细胞24h对HUVECs细胞活性的影响。然后运用平行平板流动腔装置建立LSS诱导HUVECs凋亡模型。采用Hoechst 33258荧光染色、流式细胞术检测CN对LSS诱导HUVECs凋亡的影响。实时荧光定量PCR检测CN对LSS诱导HUVECs中miR-224表达的影响;Western blot检测CN对LSS诱导HUVECs中前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)蛋白表达的影响及 miR-224-5P 对 PCSK9蛋白表的影响。运用RNAi技术向HUVECs中转染PCSK9siRNA后再用Western blot 检测 PCSK9siRNA 对 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 蛋白表达的影响。结果:CCK-8法结果表明:与对照组比,2.5umol/L的CN对HUVECs细胞活性没有影响(P0.05);5umol/L、10umol/L、20umol/L 的 CN 能够促进HUVECs细胞活性(P0.05);40umol/L CN抑制HUVECs细胞活性(P0.05);Hoechst 33258荧光染色结果显示:与静态培养组比,LSS组(3dyne/cm2,12h)内呈现凋亡形态的HUVECs明显增多。与LSS组比,CN+LSS组内呈凋亡形态的HUVECs明显减少,其中以20umol/L CN+LSS组内呈现凋亡形态的HUVECs数量最少。流式细胞术结果显示,与静态培养组比,LSS组HUVECs凋亡率明显增加,差异有显著统计学意义(P0.01);与LSS组比,CN组呈剂量依赖性减少HUVECs的凋亡率,差异具有统计学意义(P0.01)。其中以20umol/L CN+LSS组HUVECs凋亡率减少最为明显,差异具有显著统计学意义(P0.01)。实时荧光定量PCR结果显示:与静态培养组比,LSS组miR-224表达水平明显下调,差异有统计学意义(P0.01);与LSS组比,CN+LSS组miR-224表达水平逐渐上调,并且呈现浓度依赖性,差异有统计学意义(P0.05)。其中以20umol/L CN+LSS组miR-224表达水平上调最明显,差异具有显著统计学意义(P0.01)。Western blot结果显示:与静态培养组比,LSS组内PCSK9蛋白表达显著升高,差异具有统计学意义(P0.01);与LSS组比,CN+LSS组内PCSK9蛋白表达下降,并且呈现浓度依赖性,差异具有统计学意义(P0.05)。其中以20umol/LCN+LSS组PCSK9蛋白表达下降最为明显(P0.01)。转染miR-224-5P mimic,Western blot结果显示,与LSS组比,miR-224-5Pmimic明显抑制LSS上调的PCSK9表达,差异具有统计学意义(P0.01)。利用RNAi技术沉默PCSK9在HUVECs中的表达,结果显示浓度为100nM的PCSK9siRNA沉默HUVECs中PCSK9表达效果最佳(P0.01)。Western blot结果显示,与空白对照组比,LSS组Bax、Caspase-3蛋白表达上升,Bcl-2蛋白表达下降,差异具有统计学意义(P0.01);与 LSS 组比,PCSK9siRNA 组 Bax、Caspase-3蛋白表达下降,Bcl-2蛋白表达升高,差异具有统计学意义(P0.01)。结论:1.5umol/L、10umol/L、20umol/LCN 促进 HUVECs 细胞活性,40umol/L CN对HUVECs细胞活性具有抑制作用。2.CN对LSS诱导的HUVECs凋亡具有抑制作用,作用机制可能与CN上调miR-224表达、下调PCSK9表达相关。3.miR-224-5P 能够抑制 HUVECs 中 PCSK9 表达。4.PCSK9siRNA 能够抑制 LSS 诱导的 HUVECs 中 Bax、Caspase-3 蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达。
【图文】：

其中以２０ｕｍｏｌ／Ｌ邋ＣＮ邋＋邋ＬＳＳ组内呈现凋亡形态的ＨＵ邋ＶＥＣｓ减少逡逑最为明显。表明ＬＳＳ促进ＨＵＶＥＣｓ凋亡，ＣＮ呈浓度依赖性减少ＬＳＳ诱逡逑导的ＨＵＶＥＣｓ调亡。（见图２．］如红色箭头所示）逡逑ｍｍｍｍ逡逑■■逡逑图２．１不同浓度ＣＮ对ＬＳＳ诱导的ＨＵＶＥＣｓ凋亡的影响逡逑注：Ａ：静态培养组；Ｂ：ＬＳＳ邋组（３ｄｙｎｅ／ｃｍ２，１２ｈ）邋；邋Ｃ：５ｕｍｏｌ／ＬＣＮ邋＋邋ＬＳＳ逡逑组；Ｄ：邋１０ｕｍｏｌ／Ｌ邋ＣＮ邋＋邋ＬＳＳ邋组；Ｅ：２０ｕｍｏｌ／Ｌ邋ＣＮ邋＋邋ＬＳＳ邋组。（ｎ邋窆邋３）逡逑３．２．２流式细胞术检测ＣＮ对ＬＳＳ诱导ＨＵＶＥＣｓ凋亡的影响逡逑实验分为静态培养组、ＬＳＳ组、５ｕｍｏｌ／Ｌ邋ＣＮ＋ＬＳＳ组、１０ｕｍｏｌ／Ｌ逡逑ＣＮ邋＋邋ＬＳＳ组、２０ｕｍｏｌ／Ｌ邋ＣＮ邋＋邋ＬＳＳ组。运用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。逡逑结果如图２．２所示：与静态培养组比，ＬＳＳ组ＨＵＶＥＣｓ凋亡率上升明显，逡逑１９逡逑

（Ｐ＜０．邋０１），其中２０ｕｍｏＩ／ＬＣＮ＋ＬＳＳ组抑制ＨＵＶＥＣｓ凋亡的作用最强，，差逡逑异有显著统计学意义（Ｐ＜0．邋０１）。表明ＬＳＳ促进刖ＶＥＣｓ凋亡，ＣＮ对ＬＳＳ逡逑诱导ＨＵＶＥＣｓ凋亡具有抑制作用，并且呈现浓度依赖性。（见图２．邋２）逡逑Ａ逦ＳｔａｔｉＣ逦Ｂ逦ＬＳＳ逡逑ｉ0４邋°＇４0Ｓ％逦湖，逦１０４］３＇４０７＂逦２１９％逡逑３逦３逡逑１０逦１０邋ｉ逦＇邋，逡逑Ｕ逦＃逦ｂ）逡逑ｕ逦ＩＴ逡逑１。，＇身：：．逦Ａ逦娭＃逡逑１0°邋９１．８％＊逦ｌ邋３．２０％逦１０°邋６８．８°＾ｆ＾Ｐ逦５．９４％逡逑１０邋１０邋１０邋１０逦１０逦１０邋１０１逦１０＾逦１０逦１０逡逑ＦＬ１－Ｈ：：邋Ａｎｎｅｘｌｎ邋ＦＩＴＣ逦ＦＬ１－Ｈ：：邋Ａｎｎｅｘｉｎ邋ＦＩＴＣ逡逑ｑ逦５邋ｕｍｏｌ邋Ｌ邋ＣＮ＾ＬＳＳ逦Ｄ逦１邋Ｏｕｍｏｌ＇Ｌ邋ＣＮ－ＬＳＳ逡逑，。个《ｓ％逦「７邋霞。逦１０＾逦灥．逡逑１０３逦１０３邋：逡逑ｆ：邋２逦２：：逦４＾０逡逑５邋１０逦５邋１０邋Ｉ逡逑１逦＃＇逦１１邋身，逡逑ｉ0Ｕ邋７７．１％逦２．４８％逦１0邋８１．７％逦３．５５％逡逑１０°邋１0１邋１0２邋１0３逦１０逦１０邋１０逦１０逦１０逦１０逡逑ＦＬ１－Ｈ：：邋Ａｎｎｅｘｌｎ邋ＦｆＴＣ逦ＦＬ１－Ｈ：：邋Ａｎｎｅｘｌｎ邋ＦＩＴＣ逡逑Ｆ逡逑Ｅ逦２０ｕｍｏｌＬＣＮ－ＬＳＳ逦４０逡逑４邋Ｊ邋１．０５％逦９．９４％逡逑１０逦—３０逡逑３逦￡逡逑ＴＶ邋ｉ邋■：栜逦Ｉ－逦ｕｎ逦Ｍ逦“逡逑１逦１０逦ｓ．逦ｍｍ逦＾逦ｌｉｉＴｉｒｉ逡逑２逦
【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

【参考文献】

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本文编号：2692434