细胞周期调节因子在心肌肥大中的动态变化及雷公藤甲素的影响

发布时间：2020-06-03 11:30

【摘要】：心肌肥大(cardiac hypertrophy)的一个主要特征是心肌细胞体积增大,直径增宽,及肌节数量增多,而细胞数目保持不变。尽管早期对心功能具有一定的代偿作用,但长期的心肌肥大会引起心肌耗氧量增加,导致心绞痛、心律失常、心力衰竭等心血管疾病的发病率和死亡率明显增高,严重影响心血管疾病患者的预后,因而逆转病理性心肌肥大的发生发展已成为防治心血管疾病的重要举措。在哺乳动物早期胚胎中,心肌细胞分裂活跃,以适应心脏快速增长的需要。但出生后不久,周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)表达量均迅速降低,而CDK抑制因子(CDK inhibitor,CDKI)则快速增加,促使心肌细胞退出细胞周期,成为一种高度分化的终末细胞。然而,大量的研究发现,在病理刺激下,成熟的心肌细胞能重返细胞周期,细胞周期调节因子再度激活表达,共同促进DNA和蛋白质合成,但却无法顺利完成有丝分裂,表现为心肌细胞肥大。细胞周期是在细胞周期正调控因子(cyclin-CDK复合物)和负调控因子(CDKI)共同调节下完成的。研究心肌肥大过程中细胞周期调节因子的动态变化,对于深入了解心肌肥大的发生发展机制,以及寻找新的防治靶点具有重要价值。雷公藤甲素(triptolide,TP)来源于雷公藤属植物,具有调节多种肿瘤细胞周期调节因子表达的作用。然而,TP对心肌细胞周期调节因子的影响如何尚不明确。本课题旨在研究在心肌肥大过程中细胞周期调节因子的时相性表达变化及TP对其表达的影响,探讨通过调节细胞周期防治心肌肥大的可行性。方法:1.血管紧张素(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)1.0μmol·L~(-1)分别处理H9c2细胞5、10、30min,和1、2、3、6、12、24、48h,罗丹明标记鬼笔环肽染色并检测细胞面积;real-time PCR法检测细胞周期蛋白B1、D1、E1,CDK1、2、4、6,以及CDK抑制因子p21 mRNA的表达变化情况。2.分离培养新生大鼠心肌细胞(neonatal rat ventricular myocytes,NRVM),Ang II分别处理5、10、30min和1、2、3、6、12、24h,采用流式细胞术检测细胞周期的变化。3.同上方法采用Ang Ⅱ处理NRVM,分别加入雷公藤甲素(triptolide,TP)1.0μg·L~(-1)孵育不同时间。鬼笔环肽染色检测细胞面积;real-time PCR法检测β-肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)mRNA和细胞周期调节因子mRNA的表达情况;Western blot法检测蛋白表达情况。4.动物模型建立及药物干预:健康清洁级雄性C57小鼠72只,随机分为异丙肾上腺素组(isoprenaline,ISO)和TP治疗组,各6个时相点,共12组(n=6)。ISO(10mg·kg~(-1),sc,bid)制备心肌肥大模型,TP(10μg·kg~(-1)·d~(-1),ip,qd)分别处理0、1、3、7、14、21d。5.密切观察小鼠生活状况及死亡情况。末次给药后,称量体重(BW)和心重(HW),测量小鼠胫骨长度(TL),以HW/TL作为心脏指数。分别采用HE和Masson染色观察心肌组织病理变化与胶原沉积情况;麦胚凝集素染色观察计算细胞平均面积。6.采用real-time PCR法检测β-MHC及细胞周期因子cyclin A2、B1、D1、E1,CDK1、2、4、6,p21、p27 mRNA的表达变化情况;Western blot法检测β-MHC、cyclin D1、CDK4、CDK6、P21蛋白表达情况。结果:1.随着Ang Ⅱ刺激时间的延长,H9c2细胞面积逐渐增大;细胞周期调节因子均于刺激后出现短暂反应性表达增加,cyclin E1与CDK2、CDK4 mRNA在5min时达到峰值,cyclin D1 mRNA在10min时达到峰值,随后一直呈减少趋势;CDK6与cyclin B1mRNA表达出现双峰现象,分别于5和30min达第一峰,随后表达减少,于2h达最低点,接着又表达增加,于12h达第二峰。p21 mRNA表达量于30min达峰值,随后逐步减少,3h时表达最低,之后又缓慢增加。2.与H9c2细胞相比,随着刺激时间的延长,NRVM细胞肥大反应更为明显,6h后细胞面积增加呈加速趋势。与对照组相比,经TP处理后,细胞面积升高趋势明显减弱。流式细胞术检测细胞周期结果显示,在Ang Ⅱ刺激下,NRVM细胞G1期细胞数减少,S+G2期的细胞数明显增加。3.Ang Ⅱ处理5min时,NRVM细胞β-MHC、cyclin A1、p21、p27 mRNA出现反应性小幅度表达增加;p21 mRNA于30min达极大值。β-MHC mRNA于刺激6h表达最低,随后其表达量随刺激时间增加而骤升,于48h达最大值,这与细胞面积肥大结果相一致。此外,CDK1、2、4、6、cyclin B1、D1、p21 mRNA均于2h表达最低,cyclin A1和p27 mRNA表达量在1h时达最低位,cyclin E1 mRNA于3h时表达最低;之后随着刺激时间的延长,细胞周期因子表达均出现回升,cyclin A1 mRNA于3h表达达峰值;然而在Ang Ⅱ刺激24~48h,仅CDK1、p21、p27 mRNA表达升高较显著(P0.01),其它的周期正调控因子虽有缓慢增加,但均维持在较低水平;而TP在减小细胞面积的同时能够纠正细胞周期因子mRNA的异常表达。4.蛋白检测结果显示,随着Ang Ⅱ处理时间增加,β-MHC、CDK4、CDK6蛋白表达逐渐减少;而P21于刺激30min短暂升高后又迅速降低,CDK4、P21均于2h达最低值,CDK6与β-MHC均于30min达最低位,而后随刺激时间的增加而递增;在Ang Ⅱ刺激12~24h,所以蛋白表达均达到最大值。在细胞肥大过程中,就细胞周期因子在mRNA和蛋白水平上表达变化而言,Ang Ⅱ对蛋白表达的影响较mRNA更明显;而TP可明显纠正上述细胞周期因子蛋白表达异常。5.ISO处理组小鼠皮毛暗淡无光泽,呼吸急促,活动较少,反应迟钝,随着ISO作用时间增加,上述反应越明显;与模型组相比,TP组小鼠活动与进食情况明显改善。6.ISO处理3d后,小鼠HW/TL比值开始显著升高,细胞面积增大,并随着时间的延长而持续增加,同时出现心肌纤维断裂、炎细胞浸润和胶原沉积。TP能明显降低心脏指数,改善心肌组织损伤,减轻纤维化。7.在ISO诱导小鼠心肌肥大过程中,β-MHC、cyclin D1、E1、CDK2、4、6 mRNA表达逐渐减少,其中β-MHC、cyclin D1、CDK6 mRNA于1d时达最低值,cyclin E1、CDK2、4 mRNA于3d时达谷值,随后表达量均又逐渐升高;β-MHC mRNA于14d达峰值后表达略微降低。而ISO诱导小鼠1d即诱导cyclin A2、B1、CDK1 mRNA表达骤升,且cyclin B1 mRNA持续增高至3d达峰值,而其他所有周期因子均于7d时达峰值,随后一直呈减少趋势;在21d时,cyclin B1、E1 mRNA表达较正常对照组显著降低(P0.01)。p21和p27 mRNA表达量随ISO作用时间延长呈递增和递减趋势,p27 mRNA于3d时表达最低;p21、p27 mRNA均于14d达峰值,在21d时表达量虽有所降低,但仍然高于正常对照组。然而TP在减小心脏大小及改善心脏功能的同时,可显著纠正胚胎基因β-MHC及细胞周期调控因子cyclin、CDK、CKI mRNA的异常表达。8.蛋白检测结果显示,随着ISO作用时间的延长,β-MHC蛋白表达逐渐增高,于14d达峰值后表达量又减少。在ISO处理3d后cyclin D1、CDK6蛋白表达达峰值,随后一直呈减少趋势。CDK4、P21蛋白表达量均于3d达最低值,之后又快速升高。而TP可显著纠正上述周期因子蛋白异常表达。结论:1.体外培养心肌细胞株H9c2和NRVM细胞肥大反应,以及小鼠心肌肥大过程中均伴随着细胞周期调节因子的表达失衡。2.雷公藤甲素能显著抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞H9c2和NRVM肥大反应,有效减轻异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大和心肌纤维化。3.雷公藤甲素抗心肌肥大机制可能与其纠正细胞周期调节因子平衡失调有关。
【图文】：

变化情况图,变化情况,时相性,对照组

图 1. Ang II 处理后 H9c2 细胞面积变化情况罗丹明标记鬼笔环肽染色（bar=50 μm）；B. 细胞面积变化 ( x SEM，n＝与正常对照组 (0min) 比较，，*P<0.05，**P<0.01 AngⅡ诱导 H9c2 心肌细胞周期蛋白基因的时相性表达 II 刺激 H9c2 细胞 cyclin B1 mRNA 的时相性表达呈现明显的“波峰始逐渐增加至 30min 达第一个“波峰”，此时表达量达对照组的量逐渐降低，于 2h 时表达最低，出现第一个“波谷”。之后随着长，cyclin B1 mRNA 表达再次升高，于 6h 达第二次峰值后其表达 48h 其表达量基本恢复到正常水平（图 2A）。Ang II 处理 H9c2 细胞A 表达量先是缓慢增加至 10min 达最高点，较对照组增加了 15%；h 达最低位，此时表达量较正常对照组降低了 40%；之后又缓慢回至正常水平；但 48h 时，与对照组相比，其表达量再次降低 27%（

周期蛋白,心肌细胞

图 2. Ang II 对 H9c2 心肌细胞周期蛋白 mRNA 表达的影响 ( x SEM，n=6)A. cyclin B1 mRNA；B. cyclin D1 mRNA；C. cyclin E1 mRNA与正常对照组 (0min) 比较，*P<0.05，**P<0.012.2.3 AngⅡ诱导 H9c2 心肌细胞周期蛋白依赖性激酶基因的时相性表达Ang II 刺激 H9c2 细胞 5min 即诱导 CDK2 mRNA 表达明显增加，较对照组增加了1.38 倍。从 10min 开始，CDK1、2、4、6 的 mRNA 表达开始下降，其中 CDK1 mRNA在 3h 表达量降至最低位，仅为对照组的 76%，之后又迅速增高，于 24~48h 达正常对照组的 1.3 倍。随着时相点的延长，CDK2 和 CDK4 mRNA 表达呈现“阶梯式”下降，二者均于 3h 时达最低点，较正常对照组分别降低了 24%和 57%，而后虽有小幅度回升，但总体维持于较低水平。CDK6 mRNA 表达量在 Ang II 刺激 5min 达第一峰后逐渐降低，于 2h 时达“波谷”，较对照组降低了 50%；随后表达量又迅速升高至 12h达第二峰，之后又呈现下降趋势（图 3）。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】