真武汤含药血清对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响

发布时间：2020-06-03 11:25

【摘要】：目的:通过采用血清药理学方法,从不同角度观察经方真武汤含药血清对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌细胞氧化损伤及其对凋亡相关蛋白表达的影响,探讨真武汤对心肌细胞氧化损伤及凋亡的保护作用机制。为临床应用真武汤治疗心力衰竭提供科学的理论依据。材料与方法:实验动物采用新生1-3天龄的健康Wistar大鼠(雌雄不拘)20只,作为心肌细胞分离与培养用。另外取3个月龄健康雄性Wistar大鼠10只(250-270 g),制作含药血清。实验药品包括经方真武汤,其五味中药组成分别是茯苓、白术、白芍、附子、生姜。由辽宁中医药大学附属医院中草药局提供,由制剂室制备,进行煎煮后,按人和动物的等效剂量换算方法,换算出大鼠服用剂量,其剂量组相当生药量18.9g/(kg·d)。卡托普利的每片剂量为12.5毫克。首先制备真武汤含药血清及卡托普利含药血清。制备真武汤含药血清的制备方法:取正常Wistar大鼠灌服真武汤和卡托普利,计量、方法和参考文献等同体内试验部分。本实验中大鼠给药剂量的计算方法是:按照人与大鼠体表面积进行计算得到的,按照其等效剂量系数的折算方法,计算出大鼠的给药剂量,计算公式具体是:大鼠的给药物剂量(mg/kg)=成人的服药剂量(mg/d)/60kg× 7),给大鼠灌胃,连续7天。在末次灌胃1小时后从腹腔静脉取血,无菌条件下分离血清、加热灭活备用(根据国家自然科学基金重点项目“中药复方体外实验的方法学研究”课题组建议的方法)。然后进行心肌细胞分离与培养:用75%的酒精消毒,在超净台内无菌条件下打开胸腔,剪取心室部分放于盛有预冷PBS的平皿中。用吹打管吹打去除残血,移入另一平皿中,加入适量0.06%胰酶(等量0.125%胰酶和0.1%胶原酶II)。将心室肌剪成1mm3大小的碎块,移入50ml锥形瓶,37℃消化,每隔1min磁力搅拌器搅拌。消化1Omin,弃去首次消化上清液,加入适量0.06%胰酶,继续消化8min,如此反复5次,分别收集每次消化的上清液,并加入等量10%FBS培养液终止消化。1500r离心8min,弃上清液,加入适量培养液,进行吹打,制成了细胞悬液,在37℃条件培养皿中置于5%CO2培养箱里进行静置培养。根据成纤维细胞和心肌细胞贴壁时间的不相同,采用差数贴壁1.5h。48h后换液,并加入200v 5-brdu 0.1mmol/L,以抑制成纤维细胞的增殖,于37℃、5%CO2培养箱内静置培养。取其对数生长期良好和生长状态良好的细胞进行分组实验。实验分组情况:共分为四组,包括空白对照组、模型对照组、卡托普利组和真武汤组。空白对照组:换液为含10%空白大鼠血清的DMEM的培养基,进入下一步的继续培养,继续经过48h培养。模型对照组:换液为含10%空白大鼠血清+浓度为1Oμmol/L异丙肾上腺素的DMEM培养基继续培养48h。卡托普利组:换液为含10%空白大鼠血清+浓度为1Oμmol/L异丙肾上腺素的DMEM培养基+浓度为μmol/L卡托普利的DMEM培养基继续培养48h。真武汤组:换液为含浓度为浓度为1Oμmol/L异丙肾上腺素加10%真武汤含药血清的DMEM培养基继续培养48h。本实验研究是在课题前期动物实验的体内研究基础上,转入体外实验研究部分。首先通过细胞的提取与培养,异丙肾上腺素对细胞生长抑制实验,免疫荧光检测线粒体膜电位,MTT法测定吸光值,研究真武汤含药血清对心肌细胞生存和线粒体膜电位的影响,阐述真武汤含药血清对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌细胞氧化损伤具有保护作用。为进一步进行真武汤含药血清抗心肌细胞凋亡以及其抗凋亡机制的研究打下基础。通过检测细胞凋亡的不同方法从不同侧面,从形态学和定量检测方面阐述真武汤含药血清抗凋亡作用,分别是免疫荧光检测线粒体膜电位(△ Ψ)用罗丹明123(rhodamine 123)对线粒体进行染色,检测线粒体膜电位的情况;AO/EB双重荧光染色检测细胞凋亡;TUNEL分析,测定心肌培养细胞的MDA含量,计算凋亡细胞的数量;流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡率;Western-blot法测定培养心肌细胞中的Bcl-2、Bax、Caspase-3、Sirt-1等相关蛋白表达,从蛋白表达方面研究真武汤含药血清对心肌细胞氧化损伤的保护作用机制,为临床抗心力衰竭治疗提供实验和理论基础。统计学方法:统计学处理应用SPSS13.0统计软件,计数资料采用x 2检验;计量资料的分析是以均数±标准差(x±S)表示,多组间的分析采用的是单因素方差分析的方法,两组间的比较用q检验,以a=0.05,P0.05表示有统计学意义。结果:1.异丙肾上腺素对心肌细胞生长具有抑制作用,异丙肾上腺素10 μ mol/L作用于心肌细胞6h后,可明显降低细胞存活率。真武汤含药血清浓度的筛选过程中各组心肌细胞与相应干预措施作用48h后,异丙肾上腺素组、异丙肾上腺素+40%含药血清组、异丙肾上腺素+20%含药血清组、异丙肾上腺素+10%含药血清组及异丙肾上腺素+5%含药血清组细胞活性均低于空白组,差异有统计学意义(P0.05);异丙肾上腺素+卡托普利组、异丙肾上腺素+40%含药血清组、异丙肾上腺素+20%含药血清组、异丙肾上腺素+10%含药血清组及异丙肾上腺素+5%含药血清组细胞活性均高于异丙肾上腺素组(P0.05);异丙肾上腺素+20%含药血清组、异丙肾上腺素+10%含药血清组与异丙肾上腺素+卡托普利组相比细胞存活率相似,差异无统计学意义。不同浓度的真武汤含药血清作用于细胞,随着含药血清浓度升高对细胞存活率有增加作用,但同时我们考虑到含药血清的浓度越高可能对细胞毒性作用越大,而10%含药血清组与卡托普利对细胞活性影响相似的,这就为我们选定10%含药血清作为最佳浓度提供了实验依据。2.免疫荧光检测线粒体膜电位(△Ψ):模型组与正常组比较心肌细胞线粒体膜电位出现明显变化,线粒体荧光表达明显增强,而真武汤、西药组与模型组比较明显改善,线粒体荧光表达有所减弱。3.AO/EB双重荧光染色检测细胞凋亡:空白对照组可见大部分细胞的核染色质结构正常,胞膜完整,着色均匀;模型对照组可见大量坏死细胞及晚期凋亡细胞,胞膜破损、核膜完整,染色质染均匀的红色橘红色呈致密斑块或碎片状;真武汤组核染色质结构正常,胞膜完整,同时存在较多核染亮绿色呈致密斑块或碎片状的早期凋亡细胞和散在的晚期凋亡细胞及坏死细胞;卡托普利组可见大量核染亮绿色呈致密斑块或碎片状的早期凋亡细胞和核染橘红色呈致密斑块或碎片状的晚期凋亡细胞。TUNEL分析和流式细胞仪检测计算后异丙肾上腺素组凋亡率明显增加,而异丙肾上腺素+卡托普利组和异丙肾上腺素+含药血清组心肌细胞凋亡率明显低于异丙肾上腺素组。4.TUNEL分析:MDA的量常可反映细胞脂质过氧化的程度,间接地反映出细胞损伤的程度。在我们的实验结果显示,模型组MDA含量较空白组MDA含量显著增加,有显著差异(P0.05),加入真武汤后心肌细胞MDA含量与模型组相比,明显减少(P0.05)。流式细胞仪检测结果:模型对照组细胞凋亡率明显升高,与空白对照组比较有显著差异(P0.01);卡托普利组、真武汤组与模型对照组相比凋亡率明显降低,有显著差异(P0.05),真武汤组与卡托普利组相比较没有明显差异(P0.05)。5.Western blotting检测各组心肌细胞中 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Sirt-1蛋白的表达情况:模型对照组心肌细胞Bcl-2蛋白表达降低、Bax蛋白表达增加、Bcl-2/Bax比值明显降低,与空白对照组比较有显著性差异(P0.01);真武汤组和卡托普利组与模型对照组相比较,Bcl-2蛋白表达增加、Bax蛋白表达降低(P0.05);模型对照组心肌细胞Caspase-3明显降低,与空白对照组比较有显著性差异(P0.01);真武汤组和卡托普利组与模型对照组相比较,Caspase-3蛋白表达降低(P0.05);真武汤组和卡托普利组与模型对照组相比较,Sirt-1蛋白表达增加(P0.05)。结论:1.真武汤含药血清能够明显改善氧化损伤大鼠心肌细胞线粒体的膜电位;2.真武汤含药血清能够明显降低氧化损伤大鼠心肌细胞MDA含量;3.真武汤含药血清能够明显抑制氧化损伤大鼠心肌细胞的凋亡;4.真武汤含药血清能够明显降低氧化损伤大鼠心肌细胞Bax蛋白表达,提氋Bcl-2蛋白表达;5.真武汤含药血清能够明显降低氧化损伤大鼠心肌细胞Caspase-3蛋白表达,提高Sirt-1蛋白表达。
【图文】：

形态图,形态

原代细胞形态

存活率,细胞生长

细胞生长存活率实验：真武汤血清浓度筛选
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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