黄连素对细胞因子诱导的胰岛β细胞炎症损伤的保护作用

发布时间：2020-06-05 00:03

【摘要】：目的:1、前期实验表明黄连素干预胰岛β细胞INS-1后,促进了细胞胰岛素分泌,而胰岛素合成不变,本实验旨在进一步探讨其中的分子机制;2、研究黄连素对细胞因子诱导的胰岛β细胞炎症损伤的保护机制。方法:1、用1640培养基培育胰岛素瘤细胞系INS-1细胞,分别用浓度为0μM、2.5μM、5μM、10μM的黄连素干预INS-1 48h,Western blot法检测黄连素对PKA活性及CREB、AMPK、CRTC2磷酸化活性的影响;2、铺6孔板培养细胞24h后,更换培养液为含有0.2%BSA的培养液饥饿处理8h,按照以下分组进行干预:(1)空白对照组:加入等体积等浓度的DMSO(溶质);(2)阳性对照组:加入0.5mM AICAR(AMPK激动剂)干预INS-1细胞3h;(3)阴性对照组:加入10μM Compound C(AMPK抑制剂)干预INS-1细胞3h;(4)黄连素(BBR)组:加入5μM BBR干预INS-1细胞48h;(5)BBR+AICAR组:加入5μM BBR和0.5mM AICAR干预48h;(6)BBR+Compound C组:加入5μM BBR和10μM Compound C干预48h;3、萃取细胞核和细胞浆蛋白,Western blot法分别测定细胞内胰岛素分泌相关信号通路因子AMPK、CREB的磷酸化水平及细胞核内CRTC2含量;4、培育胰岛素瘤细胞系INS-1细胞,分别设置空白对照组、细胞因子混合物(5ng/ml IL-1β、10ng/ml TNF-α、100ng/ml IFN-γ)损伤组、黄连素(5μM)组、BBR+细胞因子混合物组,Western blot法分别测定细胞核内NF-κB含量的变化以及相关因子AKT、ERK1/2、AMPK磷酸化水平和L型钙离子通道Cav1.2的蛋白表达水平,测定凋亡相关蛋白,包括Bcl-2、Cleaved-caspase3的表达水平;5、用MTT法检测细胞活性;6、KRB缓冲液配制低糖(2.8mM)和高糖(16.7mM)溶液进行高糖刺激下胰岛素分泌试验(GSIS),胰岛素ELISA盒测定胰岛素分泌量的变化。结果:1、浓度为2.5μM、5μM、10μM黄连素作用于INS-1细胞,均明显促进了CREB、AMPK、CRTC2的磷酸化和PKA的活性,5μM时激活更明显,所以本实验后期黄连素干预浓度选择5μM;2、Western blot结果显示黄连素能够促进细胞内CREB的磷酸化,加入cAMP/PKA通路抑制剂H-89后,其磷酸化活性被抑制,差异有统计学意义(p0.05),同时黄连素也增强了AMPK的激酶活性,继而CRTC2 Ser171位点被磷酸化隔离在细胞质中,加入Compound C后,AMPK磷酸化活性被抑制,CRTC2发生去磷酸化入核增多,差异有统计学意义(p0.05)。3、与对照组相比,细胞因子混合物组INS-1细胞中NF-κB核内转运含量增加,其上游相关信号因子AKT磷酸化水平也增加,加入黄连素后,AKT磷酸化水平下降,NF-κB核内转运也减弱(p0.05);4、黄连素对细胞因子诱导的ERK1/2磷酸化活性的增加无明显影响,差异无统计学意义;5、黄连素逆转了细胞因子诱导的抗凋亡蛋白Bcl-2含量的下降和促凋亡蛋白caspase3的水解增加,差异有统计学意义;6、细胞因子组L型钙离子通道Cav1.2表达下降,而加入黄连素后其表达上升,差异有统计学意义(p0.05)。7、MTT结果显示细胞因子混合物组细胞活性明显降低,而加入BBR以后,细胞活性未明显改善(p0.05);8、GSIS试验结果显示:细胞因子明显降低了INS-1细胞高糖刺激下的胰岛素分泌,而加入黄连素后胰岛素分泌量有所增加,但无明显统计学差异。结论:结合前期实验结果,黄连素同时激活cAMP/PKA/CREB通路和AMPK/CRTC2通路共同调节胰岛β细胞功能;黄连素通过抑制AKT的磷酸化活性和促进AMPK磷酸化活性抑制NF-κB的核内转运保护INS-1细胞免受细胞因子诱导的炎症损伤,黄连素可以逆转细胞因子诱导的抗凋亡蛋白Bcl-2含量的下降和促凋亡蛋白caspase3的水解增加发挥抗凋亡作用;细胞因子通过抑制Cav1.2表达使INS-1细胞胰岛素分泌降低,而黄连素可以逆转Cav1.2的表达。
【图文】：

黄连素,细胞因子诱导,细胞因子,混合物

学硕士学位论文二、黄连素对细胞因子诱导的胰岛 β 细胞损伤 2.1 所示：与空白对照组相比，，细胞因子混合物组细胞核异有统计学意义（*p<0.05），当加入黄连素后细胞核内 NF统计学意义（# 与细胞因子混合物组相比，p<0.05），说B 的入核；另外我们还发现与空白对照组相比，单纯黄连明显变化，差异无统计学意义（p>0.05），而黄连素和细的实验组 NF-κB 的入核相对于细胞因子混合物组明显减（# 与细胞因子混合物组相比，p<0.05）；说明黄连素可炎作用，保护 INS-1 细胞免受炎症因子的损伤。如图 2.1

黄连素,细胞因子诱导,细胞因子,磷酸化

天津医科大学硕士学位论文二、黄连素对细胞因子诱导的胰岛 β 细胞损伤的保护作用为了进一步探究 NF-κB 与 AKT 的磷酸化水平是否直接相关，我们加入了 AKT抑制剂 KP372-1，发现 NF-κB 的入核同样减少，如图所示，KP372-1 与细胞因子混合物组细胞核内 NF-κB 含量减少（#与细胞因子混合物组相比，p<0.05），所以我们猜测黄连素可能通过抑制 AKT 的磷酸化水平从而抑制 NF-κB 的核内转运。如图 2.2 所示。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】