金铃子散及其拆方抗炎镇痛的代谢组学研究

发布时间：2020-06-05 12:36

【摘要】：中药复方是中医临床治疗疾病的重要手段,其临床应用已有两千多年的历史。即使在目前西药发展如此迅速的时代,中药在治疗慢性疾病或疾病恢复调整中发挥着非常重要的作用。代谢组学旨在通过分析代谢产物中的小分子化合物,反向追踪已发生的病变和代谢通路来研究药物的作用机制。应用代谢组学技术探讨中药的作用机制为中药复方及其配伍研究提供一种新思路。中药复方金铃子散由川楝子和延胡索按1:1配伍而成,首见于金元四大家之一“寒凉派”代表刘完素的《素问·病机气宜保集》,是治疗肝郁化火而致的各种痛症的代表方剂。目前金铃子散主要用于治疗胃及十二指肠溃疡、慢性胃炎、慢性肝炎、胆囊炎等疾病。国内对金铃子散的研究主要为药物配比、炮制方法、药理学研究,而其相关作用机理研究尚不明确。为了探索金铃子散及其拆方在治疗疾病中的作用机制和代谢路径,本研究建立醋酸扭体、热板、角叉菜胶致足肿胀模型,结合气相色谱与质谱联用(GC/MS)及液相色谱与质谱联用(HPLC/MS)技术,寻找相关差异性代谢物,构建代谢网络图,从代谢水平上揭示金铃子散抗炎镇痛机理。一、金铃子散质量标准研究为保证金铃子散的质量可控,对金铃子散中两味中药的主要有效成分进行含量测定,为后续金铃子散抗炎镇痛的药效学研究奠定基础。本研究以川楝素和延胡索乙素为标准品,对2015版《中国药典》中记载的川楝子和延胡索含量测定方法进行了改进,并进行了含量测定和方法验证。结果显示川楝子和延胡索中有效成分含量均符合药典的相关要求。二、延胡索镇痛作用机制的代谢组学研究为探索延胡索治疗痛症的作用机制,本研究采用醋酸扭体法动物模型,观察小鼠扭体抑制率来评价其镇痛活性。通过GC/MS对小鼠血清进行分析,将GC/MS采集到的数据导入到XCMS中得到相关数据矩阵,为将数据可视化,将其导入到SIMCA-P或Met PA中进行PCA、PLS-DA、OPLS-DA分析。结果显示:空白对照组与模型组生物代谢物轮廓变化明显,共筛选出甘氨酸、脯氨酸、亮氨酸、柠檬酸等18种差异性代谢物。将相关差异性代谢物导入到Met PA中进行通路富集,得到延胡索干预痛症的相关代谢通路,其中影响较大的有甘油脂代谢,乙醛酸和二羧酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,亚油酸代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成。镇痛作用机制主要与中枢神经系统和外周致痛物质分泌有关。三、川楝子镇痛作用机制的代谢组学研究为探索川楝子对痛症影响的作用机制,本实验采用化学刺激痛(醋酸扭体法)小鼠模型,观察其镇痛效果。药理学结果表明,川楝子对小鼠扭体抑制率有较好的效果。小鼠血清的GC/MS代谢组学分析,共筛选出丙氨酸、丝氨酸、苹果酸等13个差异性代谢物。相关度较高的代谢通路为甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,甘油脂代谢,乙醛酸和二羧酸代谢以及转运RNA-酰胺酰类生物合成。其作用机制主要与中枢神经系统途径有关。四、金铃子散及其拆方镇痛作用的代谢组学研究为进一步比较金铃子散及其拆方镇痛作用机制的异同,本实验采用热板法和醋酸扭体法动物模型,观察小鼠痛阈提高率和扭体抑制率,比较复方中药及其单味药镇痛效果。结果显示:复方中药镇痛效果优于单方。采用GC/MS技术测定小鼠血清共筛选出甘氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等14个与痛症相关的差异性代谢物。通过Met PA进行代谢通路富集,发现代谢通路甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成与痛症相关度较高。代谢网络图显示,金铃子散复方镇痛的作用机制主要与中枢神经系统和外周致痛物质的分泌有关。五、金铃子散及其拆方抗炎作用的代谢组学研究为探索金铃子散及其拆方对炎症大鼠模型体内代谢物变化的影响,本研究采用角叉菜胶致大鼠足肿胀模型,观察造模后各组大鼠足肿胀情况,检测大鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素1β(IL-1β)含量。结果显示:模型组较空白对照组足肿胀程度明显提高(p0.05),IL-6、IL-1β和TNF-α水平均明显提高(p0.05)。将收集到的血清采用GC/MS技术分析,尿液采用HPLC/MS分析,从血清和尿液中一共筛选出谷氨酰胺、丙氨酸、琥珀酸等28种与炎症相关的差异性代谢物。将相关的差异性代谢物进行网络富集,得到β-丙氨酸代谢,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢等与炎症相关度较高的代谢通路。将这些代谢通路绘制成网路图对其抗炎作用机制进行解释。金铃子散抗炎作用机制主要为免疫调节,抑制白细胞趋化、移动和活化,其中影响较大的为细胞因子途径和核转录因子-κB途径。
【图文】：

12e图 2-1 延胡索含量测定的色谱图;（a）延胡索对照品、（b）延胡索醇提液、（c）金铃子散醇提液、（d）延胡索水提液、（e）金铃子散水提液Fig.2-1 Chromatogram of Corydalis Yanhusuo content determination; (a) Corydalis Yanhusuostandard product map、(b) Corydalis Yanhusuo alcohol extract、(c) Jinlingzisan alcohol extract、(d) Corydalis Yanhusuo water extract、(e) Jinlingzisan water extract2.6.2 方法学考察结果2.6.2.1 线性关系考察对照品浓度与峰面积的线性回归方程为 y=16.928x-38.155（R2=0.9983），线性范围为 26.8～64.0 μg·ml-1。

13图 2-2 延胡索乙素标准曲线图Fig. 2-2 Tetrahydropalmatine standard curve 精密度试验铃子散醇提液连续进样 6 针后，，色谱峰面积的 RSD（n=6）为 0.3表 2-4 精密度试验结果Table 2-4 Date of instrument precision testNo. 峰面积（mAU*s）1 829.92 822.13 829.6
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2698065