基于HPA轴及BDNF-ERK-ECS信号通路探讨酸枣仁—五味子药对的抗焦虑作用及其机制

发布时间：2020-06-06 05:12

【摘要】：目的焦虑是世界上最常见的精神障碍之一[1],是日益增长的全球关注的健康问题。焦虑症属中枢神经系统常见的精神疾病,以急性焦虑反复发作为特征,包括广泛性焦虑和发作性惊恐状态两种临床表现形式。临床上焦虑症发作常伴有头晕、胸闷、心悸、呼吸困难以及睡眠障碍等[2]。在精神障碍中,焦虑症的终身患病率最高,影响到30%的人口的寿命[3,4]。在美国,有近五分之一的成年人生活受其影响[5,6]。在我国,焦虑症已成为现代常见病和多发病,严重影响了人们的生活质量。西药治疗焦虑症疗效确切,但其服药时程长,副作用较大,中药治疗焦虑症安全有效、副作用小。因此,在中药中寻找抗焦虑的有效药物成为亟待解决的问题。药对是联系中药和方剂的桥梁,对药对的研究不仅有助于指导临床科学用药,提高临床疗效,还可以进一步揭示方剂配伍理论的科学内涵及充实中医药理论。酸枣仁-五味子为临床常用滋养安神药对。酸枣仁为中医首选安神药[7],来源于鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子。五味子是滋养安神常用中药[8],为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill的干燥成熟果实。两者常以不同配伍比例相须用于许多中医方剂和现代中药复方中。酸枣仁-五味子配伍比例不同,功效主治亦不同[9]。近年来,对酸枣仁-五味子药对的研究,多集中于1:1配伍比例下的化学成分分析及镇静、催眠的药理作用,酸枣仁-五味子药对的抗焦虑作用研究尚属空白。那么,在不同配伍比例下,酸枣仁-五味子药对是否具有抗焦虑的潜力?抗焦虑药效如何?抗焦虑的主要作用机制又是怎样的呢?这些问题值得我们深究。方法1.在酸枣仁-五味子药对(SWHP)抗焦虑指标性成分尚不明确的前提下,以其抗焦虑药效为指标,通过正交试验筛选SWHP抗焦虑作用的最佳提取方法、配伍比例及给药剂量。2.通过小鼠高架十字迷宫实验(EPM)、小鼠明暗箱实验(LDB)、小鼠旷场实验(OFT),以及束缚应激焦虑大鼠行为学实验和空瓶应激致焦虑大鼠行为学实验,探讨SWHP(2:1)的抗焦虑药效。3.基于DA能系统和5-HT能系统深入探讨SWHP(2:1)对小鼠脑内神经递质含量的影响。4.基于束缚应激焦虑大鼠及空瓶应激致焦虑大鼠模型,探讨SWHP(2:1)对大鼠血清下丘脑-垂体-肾上腺轴的影响;对大鼠皮层和海马脑内神经性营养因子(BDNF)蛋白表达和胞外调节激酶(ERK)通路的影响以及对内源性大麻素(ECS)信号通路的影响。5.采用HPLC-LTQ Orbitrap MS技术分析鉴定酸枣仁单煎液、五味子单煎液及酸枣仁-五味子合煎液中的化学成分,为后期深入探索酸枣仁-五味子药对抗焦虑药效物质基础奠定实验依据。结果主要研究内容及结果如下:1.正交试验筛选SWHP抗焦虑作用的最佳提取方法、配伍比例及给药剂量根据前期文献研究及工作基础,以提取方法(水提、醇提、醇水双提)、酸枣仁-五味子配伍比例(1:1,2:1,3:1)及给药剂量(酸枣仁-五味子生药量1g/kg,2g/kg,3g/kg)为考察指标设计正交表,采用抗焦虑药效为观察指标,根据正交表进行小鼠药效学研究,通过小鼠高架十字迷宫实验分析正交试验各组对小鼠开臂次数百分比及开臂时间百分比的影响,结果表明SWHP在采用醇水双提法及配伍比例为2:1的情况下抗焦虑作用效果较好,给药剂量初步筛选为酸枣仁-五味子生药量1g/kg-3g/kg。2.药效学研究2.1 SWHP(2:1)对小鼠的抗焦虑作用研究小鼠高架十字迷宫实验结果显示,与空白组相比,SWHP的剂量为2g/kg和3g/kg时,可显著性提高小鼠的开臂次数百分比及开臂时间百分比;明暗箱实验结果显示,与空白组相比,SWHP的剂量为2g/kg时,可显著增加小鼠进入明箱的次数及时间,SWHP的剂量为3g/kg时,可显著增加小鼠在明箱中活动的时间;小鼠旷场实验结果显示,与空白组相比,SWHP的剂量为2g/kg时,可显著增加小鼠进入中央区的次数及时间,SWHP的剂量为3g/kg时,可显著增加小鼠进入中央区的次数,并且各组对小鼠的运动距离没有显著影响。2.2 SWHP(2:1)对束缚应激模型大鼠的抗焦虑作用研究采用束缚应激对大鼠进行焦虑造模,应用旷场实验和高架十字迷宫实验进一步评价SWHP(2:1)的抗焦虑作用。实验结果表明,与空白组相比,束缚组显著降低大鼠进入中央区的次数及时间,大鼠进入开臂时间百分比和开臂次数百分比,说明造模成功,大鼠出现焦虑情绪,与束缚组相比,SWHP中剂量(1.5g/kg)可显著增加大鼠进入中央区的次数及时间,SWHP高剂量(3.0g/kg)可显著增加大鼠进入中央区的时间,并且不影响大鼠的自主活动。束缚应激后高架十字迷宫实验结果表明,与束缚组相比,SWHP中、高剂量组(1.5g/kg、3.0 g/kg)可显著增加大鼠进入开臂次数及时间的百分比,SWHP低剂量组(0.75g/kg)可显著增加大鼠进入开臂次数百分比。2.3 SWHP(2:1)对空瓶应激模型大鼠的抗焦虑作用研究实验结果表明,与空白组相比,模型组可显著降低大鼠进入中央区的次数、时间及大鼠进入开臂时间百分比和开臂次数百分比,说明造模成功。在旷场实验中,与模型组相比,SWHP中剂量(1.5g/kg)可显著增加大鼠进入中央区的次数及时间,SWHP高剂量(3.0g/kg)可显著增加大鼠进入中央区的时间;高架十字迷宫实验结果显示,与模型组相比,SWHP中剂量(1.5g/kg)可显著增加大鼠进入开臂次数百分比及开臂时间百分比,SWHP高剂量(3.0g/kg)可显著增加大鼠进入开臂次数百分比。3.机制探讨3.1 SWHP(2:1)对小鼠DA能系统和5-HT能系统的影响采用高效液相-电化学检测法(HPLC-ECD)检测小鼠脑组织中单胺类神经递质的含量,包括多巴胺(DA)及其代谢产物二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA),5-羟色胺(5-HT)及其代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)。结果显示,与空白组相比,SWHP中剂量(2g/kg)可显著降低DA及其代谢产物DOPAC的含量,以及5-HT及其代谢产物5-HIAA的含量。SWHP高剂量(3g/kg)可显著降低DA的含量,以及5-HT及其代谢产物5-HIAA的含量。据此推测SWHP(2:1)的抗焦虑作用机制与DA能系统和5-HT能系统有关系。3.2 SWHP(2:1)对束缚应激大鼠的抗焦虑作用机制研究采用酶联免疫吸附法检测了 SWHP(2:1)对束缚应激大鼠血清HPA轴相关激素促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)含量,结果显示,大鼠急性束缚应激模型能引起HPA轴亢进,表现为CRF、ACTH、CORT水平的显著增加,与束缚组相比,SWHP(2:1)中、高剂量组均可显著降低急性束缚应激大鼠血清HPA轴各激素含量。据此推测SWHP(2:1)的抗焦虑作用机制可能是:抑制束缚应激所造成的HPA轴各激素含量升高,缓解HPA轴的过度亢奋,从而达到抗焦虑作用效果。通过蛋白免疫印迹法和免疫组织化学法检测SWHP(2:1)对束缚应激模型大鼠脑内BDNF-ERK-ECS信号通路的影响,实验结果显示,与空白组相比,束缚组大鼠皮层及海马中p-ERK1/2和p-CREB表达水平显著升高,与束缚组相比,SWHP(2:1)中、高剂量组显著降低了大鼠皮层及海马中p-ERK1/2和p-CREB的表达水平;与空白组相比,束缚组可显著降低大鼠皮层及海马中BDNF的表达,与束缚组相比,SWHP(2:1)中、高剂量组可显著增加大鼠皮层及海马中BDNF的表达;与空白组相比,束缚组大鼠海马CA1区CB1及CB2阳性细胞数显著降低,与束缚组相比,SWHP(2:1)中、高剂量组阳性细胞数显著升高。实验结果提示,SWHP(2:1)可能通过调节BDNF-ERK-ECS信号通路发挥其抗焦虑作用。3.3 SWHP(2:1)对空瓶应激大鼠的抗焦虑作用机制研究采用酶联免疫吸附法检测了 SWHP(2:1)对空瓶应激大鼠血清HPA轴相关激素促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮(CORT)含量,结果显示,大鼠空瓶应激模型能引起HPA轴亢进,表现为CRF、ACTH、CORT水平的显著增加,与空瓶应激组相比,SWHP(2:1)中剂量组均可显著降低空瓶应激大鼠血清HPA轴各激素含量,SWHP(2:1)高剂量组均可显著降低空瓶应激大鼠血清CRF和CORT的含量。据此推测SWHP(2:1)的抗焦虑作用机制可能是:抑制空瓶应激所造成的HPA轴各激素含量升高,缓解HPA轴的过度亢奋,从而达到抗焦虑作用效果。通过蛋白免疫印迹法和免疫组织化学法检测SWHP(2:1)对空瓶应激大鼠脑内BDNF-ERK-ECS信号通路的影响,实验结果显示,与空白组相比,空瓶应激组大鼠皮层及海马中p-ERK1/2和p-CREB表达水平显著升高,与空瓶应激组相比,SWHP(2:1)中、高剂量组显著降低了大鼠皮层及海马中p-ERK1/2和p-CREB的表达水平;与空白组相比,空瓶应激组可显著降低大鼠皮层及海马中BDNF的表达,与空瓶应激组相比,SWHP(2:1)中剂量组可显著增加大鼠皮层及海马中BDNF的表达;与空白组相比,空瓶应激组大鼠海马CA1区CB1及CB2阳性细胞数显著降低,与空瓶应激组相比,SWHP(2:1)中、高剂量组阳性细胞数显著升高。实验结果提示,SWHP(2:1)可能通过调节BDNF-ERK-ECS信号通路发挥其抗焦虑作用。4.采用HPLC-LTQ Orbitrap MS技术分析鉴定酸枣仁单煎液、五味子单煎液及酸枣仁-五味子合煎液中的化学成分。建立了稳定的HPLC-LTQ Orbitrap MS条件,分别在正负离子模式下对酸枣仁单煎液、五味子单煎液及酸枣仁-五味子合煎液进行分析,使得所有成分具有良好的分离度,优化质谱条件使得各成分裂解碎片稳定,裂解信息全面。根据二级质谱碎片及酸枣仁、五味子已报道的相关研究进行成分鉴定。共鉴定出77个化合物,其中酸枣仁单煎液中鉴定出44个化合物,主要为生物碱、黄酮苷、皂苷类成分,包括酸李碱、斯皮诺素、当药黄素、酸枣仁皂苷B等;五味子单煎液中鉴定出32个化合物,主要为木脂素类成分,包括五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子酯丙,戈米辛D、E、G、J、K1、K2、M1、M2等;合煎液中鉴定出1个特征化合物(戈米辛L2),29个共有化合物:与酸枣仁中相同的成分有2个(酸李碱和Ceanothic acid),五味子中成分27个(主要为戈米辛E、G、J、K1、K2、M1、M2、柠檬酸、异柠檬酸、五味子木脂素类等)。由此看出酸枣仁、五味子在2:1配伍应用后,酸枣仁中成分种类大量减少,其原因有待进一步探究,同时伴随有特征成分产生(戈米辛L2及未知成分),未知特征成分有待进一步分析鉴定,本部分实验为后期深入探索酸枣仁-五味子药对抗焦虑药效物质基础奠定了良好的实验依据。结论本课题针对焦虑症这一常见的神经系统疾病,在深入分析酸枣仁-五味子药对古今临床用药规律的基础上,以复方中药的配伍理论为指导,以抗焦虑药效为指标,首次采用正交试验筛选出了 SWHP具有抗焦虑作用的最佳配伍比例及提取方法,并确定了给药剂量;采用三个经典小鼠行为学实验(EPM、LDB、OFT)初步评价了酸枣仁-五味子药对的抗焦虑药效,以及对DA能系统和5-HT能系统的影响;采用束缚应激和空瓶应激致焦虑动物模型,从“身体束缚”和“心理刺激”两个角度,较全面地验证并探讨了该药对的抗焦虑作用;通过HPA轴及BDNF-ERK-ECS信号通路这一系统的机制研究方法,对该药对的抗焦虑作用机制进行了深入阐释;利用现代分离技术初步分析鉴定比较了单煎液和合煎液中的化学成分,为进一步研究酸枣仁-五味子药对抗焦虑药效物质基础提供了实验依据。通过以上研究,将药效-机制-化学三者相结合,全面探讨酸枣仁-五味子药对的抗焦虑药效,丰富了酸枣仁-五味子药对理论;从神经递质-HPA轴-ERK-ECS通路多角度切入,开辟了焦虑症机制研究的新方向,为从药对理论角度研发新型、独特的抗焦虑药物提供了理论依据。
【图文】：

酸枣仁,五味子,方剂,药对

１）酸枣仁－五味子药对的用量比与涉及的疾病相关性分析逡逑通过分析酸枣仁－五味子药对所在方剂中两味中药用量的比例，可发现酸枣仁与五逡逑味子在方剂中的用量比例关系主要有３７种，可归纳为四种情况加以讨论。如图１所示，逡逑横坐标为用量比，纵坐标为用量比出现的频数统计。逡逑１００逦８７逡逑９０」逦秦逡逑１逦Ｉ逡逑＾邋１0邋］逦Ａ逡逑＾邋１１逦１１８邋＊邋／Ｕ５逡逑２0邋；邋１邋１邋１邋３邋３邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋１邋ｉ邋２邋４邋６邋ｘ邋ｉ邋３邋ｎ邋ｉ邋２＾５６３逦ｌ／Ｖｊ逡逑0ｒ0ｒ0ｃｒ＞＜Ｎ0ｒ0ａ）ＬｎＬｎｒｓｊＴＨＬｒ＞ｏｉ？＾0ｒ0ＴＨ＾逡逑0逦ｒｓ逦ｒＨ逦ｌ0逦ｖ３逡逑＾００逦．．逦ｉ／ｉ逦．．逦ｏｏｏｏ？ｉｊＬｎ？；ｒ？ｓｒ＜ｖｊｒｏ逦．．逦0４邋ｔ－５逡逑？？邋0Ｌｎ00ｒＮｆ0ｖＨＴＨ逦ｒ0逦＜逡逑ｒ

方剂,病证,酸枣仁,内科疾病

逑分析数据发现，酸枣仁－五味子药对所在方剂治疗疾病科属主要涉及：中医内科、逡逑中医外科、中医妇科、中医儿科、中医骨伤科、中医眼科等６类。如图２所示。逡逑２５０邋１逡逑２０６逡逑２００邋－邋■逡逑１５０逦■逡逑１００邋－邋■逡逑５０邋－Ｉ邋■逡逑Ｉ邋Ｉ逦２５逡逑■逦逦邋２逦１逦４逡逑中医内科中医外科中医妇利中医儿科中医骨伤科中医服科逡逑图２酸枣仁－五味子药对方剂所涉及疾病科属逡逑由图２可知，２４２首方剂中治疗中医内科疾病的方剂最多，共２０６首，出现的频率逡逑最高，为８５．１２％；中医妇科次之，共２５首，出现的频率分别为１０．３３％。逡逑由上述内容可知，酸枣仁－五味子药对所在方剂以治疗中医内科疾病为主，按照中逡逑医内科学教材对内科疾病的分类及各种类疾病的特点，，与方剂功效主治相联系，可将治逡逑疗中医内科疾病的方剂分为以下几种。咳嗽、气喘等病证归属肺系病证；心悸、怔忡、逡逑失眠和健忘等病证的归属心系病证；眩晕、头痛、神志异常等病证归属脑系病证；腹泻、逡逑胃脘不适等病证归属脾胃系病证；胁肋胀痛、中风等病证归属肝胆系病证；阳瘘、遗精、逡逑早泄等病证归属肾系病证；气、血、津、液运行失常、输布失度、生成不足、亏损过度逡逑等相关病证归属气血津液病证；肢体疼痛、麻木、肢体不利或屈伸不利等病证归属肢体逡逑经络病证。如图３所示。逡逑２５逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】