清达颗粒对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响及机制研究

发布时间：2020-06-06 18:47

【摘要】：目的通过体内外实验研究清达颗粒(Qingda granule,QDG)对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖和迁移的影响,并探讨其作用的分子机制,以期为临床上QDG治疗高血压、保护靶器官提供进一步的实验依据。方法1.动物实验:18只10周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为Control组:生理盐水(埋泵)+生理盐水(灌胃);AngⅡ组:AngⅡ(埋泵)+生理盐水(灌胃);AngⅡ+QDG组:AngⅡ(埋泵)+QDG(灌胃)。采用鼠尾套管无创血压仪监测小鼠血压,4周后进行取材,收集小鼠胸主动脉,免疫组化检测胸主动脉增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)的表达。2.细胞实验:(1)VSMCs的分离及鉴定:采用组织贴块法体外培养SD大鼠胸主动脉VSMCs,用免疫荧光染色对细胞进行鉴定,传代后的3-6代用于实验。(2)QDG及AngⅡ的浓度选择:用不同浓度的QDG及AngⅡ干预VSMCs,采用MTT法检测细胞活力。(3)QDG对AngⅡ诱导VSMCs的生物学影响及分子机制:将VSMCs分为Control组、AngⅡ组、AngⅡ+QDG 0.125 mg/mL组、AngⅡ+QDG 0.25 mg/mL组、AngⅡ+QDG 0.5mg/mL组,共5组。通过倒置显微镜观察和细胞计数评估VSMCs的生长情况;采用MTT法检测细胞活力;采用划痕实验和Transwell实验观察细胞迁移;通过Western blot检测PCNA及MAPK和PI3K/AKT通路中相关蛋白的表达。结果1.动物实验:QDG干预4周后,对AngⅡ诱导高血压模型小鼠的收缩压、舒张压及平均动脉压均有显著的改善作用。免疫组化结果显示,QDG能抑制AngⅡ诱导高血压模型小鼠胸主动脉PCNA表达的上调。2.细胞实验:(1)培养3代的VSMCs经倒置显微镜观察及免疫荧光检测显示,纯度95%以上,鉴定为VSMCs。(2)QDG在浓度为0~0.5 mg/mL范围内,对大鼠胸主动脉VSMCs没有细胞毒性,AngⅡ在浓度为0.01~1μM范围内,对大鼠胸主动脉VSMCs均具有增殖作用。因此选用QDG(0.125、0.25、0.5 mg/mL)和AngⅡ(1μM)用于后续实验。(3)倒置显微镜观察发现,QDG干预后能显著抑制AngⅡ诱导的VSMCs生长,这个结果通过细胞计数得到了进一步证实。MTT检测显示,QDG干预后能显著降低AngⅡ诱导的VSMCs活力增加。Western blot分析显示,QDG干预后,能显著下调AngⅡ诱导VSMCs PCNA的表达。(4)划痕实验及Transwell实验结果显示,QDG干预后能显著抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移。(5)Western blot检测结果显示,1μM的AngⅡ能上调VSMCs中p-p38、p-JNK、p-ERK1/2、p-AKT的表达,并于5 min左右达到高峰,而对总的p38、JNK、ERK1/2、AKT无影响。QDG预处理12 h能显著下调AngⅡ诱导的p-p38、p-JNK、p-ERK1/2、p-AKT的表达,对总的p38、JNK、ERK1/2、AKT无影响。结论QDG能显著抑制AngⅡ诱导高血压模型小鼠血压的升高和胸主动脉VSMCs的增殖;QDG抑制VSMCs的增殖和迁移可能是通过抑制MAPK和PI3K/AKT通路的活化来实现的。我们的结果为QDG的临床高血压治疗提供了进一步的实验依据。
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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