自噬对缺氧诱导心脏微血管内皮细胞间质转分化和梗死后心肌纤维化的调控及机制

发布时间：2020-06-07 06:38

【摘要】：第一部分自噬对缺氧诱导的心肌微血管内皮细胞间质转分化的调节及机制目的:1、研究缺氧对人心脏微血管内皮细胞(human cardiac microvascular endothelial cells,HCMECs)间质转分化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)及自噬的影响;2、研究自噬对缺氧诱导的HCMECs EndMT的影响及具体机制。方法:1、探究缺氧状态下对HCMECs EndMT的影响。实验主要分为2组(1)control组:常氧(21%O2、5%CO2、74%N2,37℃)条件下培养HCMECs3天;(2)hypoxia组:缺氧(1%O2、5%CO2、74%N2,37℃)条件下培养HCMECs3天,分别对两组细胞进行如下实验:⑴光学显微镜下观察两组细胞形态学变化;⑵RT-PCR测定各组细胞中CD31、E-cadherin、αSMA、FSP-1及Snail mRNA相对表达水平;⑶Western blot测定两组细胞CD31、E-Cadherin、ɑSMA、FSP-1、Snail蛋白表达水平;⑷双重免疫荧光染色观察CD31、αSMA及FSP-1表达变化及并对CD31+αSMA+/FSP+双阳性细胞(说明正在发生EndMT的细胞)和CD31-SMA+/FSP+细胞(说明已经发生EndMT的细胞)计数分析。2、探究缺氧状态下HCMECs自噬水平的变化。⑴HCMECs缺氧3天内LC3蛋白的表达动态变化,通过Western blot法测定HCMECs缺氧0,2,4,6,12,24,48,72 h处LC3表达变化;⑵将细胞分为以下4组:(1)control组:常氧条件下培养HCMECs;(2)氯喹(Chloroquine,CQ)(20μm)组:常氧条件下加入氯喹处理HCMECs 8小时;(3)hypoxia组:缺氧条件下培养HCMECs 6小时;(4)hypoxia+CQ(20μm)组:常氧条件用氯喹处理HCMECs 2小时,缺氧培养6小时;Western blot法分别测定各组LC3表达变化;⑶转染GFP-LC3质粒的HCMECs在缺氧3天内GFP-LC3表达动态变化,通过激光共聚焦观察HCMECs缺氧0,2,6,12,24,36,48,72 h处GFP-LC3表达变化。3、探究缺氧状态下自噬对HCMECs EndMT的影响及相关机制。实验主要分为以下5组(1)control组:常氧条件下培养HCMECs 3天;(2)hypoxia组:缺氧条件下培养HCMECs 3天;(3)hypoxia+雷帕霉素(rapmycin,rap)(100nm)组:雷帕霉素预处理细胞2小时,后将HCMECs置于缺氧条件下培养3天;(4)hypoxia+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)(5mm)组:3-MA预处理细胞2小时,后将HCMECs置于缺氧条件下培养3天;(5)hypoxia+CQ(20μm)组:氯喹预处理细胞2小时,后将HCMECs置于缺氧条件下培养3天。分别对各组细胞进行如下实验:⑴双重免疫荧光染色观察CD31及αSMA表达变化并对CD31+αSMA+双阳性细胞和CD31-SMA+细胞计数分析;激光共聚焦显微镜下观察Snail及LC3在HCMECs的共定位;⑵RT-PCR测定各组细胞中CD31、E-Cadherin、αSMA、FSP-1、Snail、TGFβ2、Smad2及Smad3的mRNA表达水平并比较分析;⑶Western blot测定各组细胞中CD31、E-cadherin、αSMA、FSP-1、Snail、LC3、beclin1、TGFβ2、Smad2、p-Smad2、Smad3及p-Smad3蛋白表达并比较分析。结果1、缺氧诱导HCMECs发生EndMT:⑴光学显微镜可见:control组HCMECs保持典型的铺路石或鹅卵石样内皮细胞样外观;而缺氧状态下细胞逐渐呈纺锤型样变化,且随时间变化愈明显。⑵RT-PCR结果显示:与control组相比,hypoxia组HCMECs的CD31、E-cadherin mRNA表达下降,而αSMA、FSP-1及Snail mRNA表达升高(P0.05)。⑶Western blot结果显示:与control组相比,hypoxia组HCMECs的CD31、E-cadherin蛋白表达下降,而αSMA、FSP-1及Snail蛋白表达升高(P0.05)。⑷双重免疫荧光染色结果显示:与control组相比,hypoxia组HCMECs中CD31表达逐渐减弱,αSMA/FSP-1强度逐渐增强,CD31+αSMA+/FSP+双阳性细胞明显增加甚至出现CD31-SMA+/FSP+细胞(P0.05)。2、缺氧诱导HCMECs发生EndMT:⑴Western blot结果显示:当HCMECs缺氧培养3天时,在4小时处LC3-I向LC3-II转化增加,12至24小时达高峰,随着缺氧时间延长略有下降(P0.05)。⑵western blot结果示:相比于control组,hypoxia组和CQ组LC3 II增加,氯喹使缺氧状态下LC3 II增加更显著(P0.05)。⑶GFP-LC3斑点聚集试验结果示:当HCMECs缺氧培养3天时,GFP-LC3荧光表达在约4-6小时开始开始由弥撒分布向聚集颗粒状转变,12小时至24小时这种聚集状态升至高峰,随着缺氧时间延长这种聚集改变下降,但仍高于对照组水平(P0.05)。3、缺氧状态下自噬对HCMECs EndMT的影响及相关机制:⑴双重免疫荧光染色结果显示:相比hypoxia组,hypoxia+rap组CD31表达强度增加,αSMA表达强度下降,而hypoxia+3-MA/CQ组CD31表达强度进一步下调,αSMA表达强度进一步增加。相比control组,hypoxia组Snail和LC3表达强度增加;相比hypoxia组,hypoxia+rap组LC3表达强度进一步增加和Snail表达强度下降,hypoxia+3-MA组LC3表达强度下降和Snail表达强度增加,hypoxia+CQ组LC3和Snail表达强度都进一步增加(P0.05)。⑵RT-PCR结果显示:相比hypoxia组,hypoxia+rap组TGFβ2、smad2、smad3及Snail mRNA表达未见明显改变,CD31、E-cadherin mRNA表达上调,αSMA、FSP-1表达下调(P0.05),hypoxia+3-MA/CQ组TGFβ2、smad2、smad3及Snail mRNA表达未见明显改变,CD31、E-cadherin mRNA表达下降,αSMA、FSP-1表达上调(P0.05)。⑶Western blot结果显示:雷帕霉素增加了缺氧状态下自噬相关蛋白LC3,beclin1的表达,抑制了缺氧诱导的CD31、E-cadherin的下调及αSMA、FSP-1、Snail的上调,3-MA和氯喹抑制了缺氧状态下自噬的发生,进一步促进了缺氧引起的CD31、E-cadherin的下调及αSMA、FSP-1、Snail的上调(P0.05)。缺氧状态下,TGFβ2、p-smad2和p-smad3表达上调(P0.05);相比hypoxia组,缺氧联合雷怕霉素、3-MA或氯喹后TGFβ2、p-smad2和p-smad3表达均未见明显改变。结论1、缺氧能同时诱导HCMECs发生EndMT及自噬;2、缺氧可通过激活TGF-β信号通路引起EndMT;3、缺氧诱导的自噬对内皮细胞具有保护性作用,可通过促进Snail降解抑制EndMT。第二部分自噬对心肌梗死后EndMT及心肌纤维化的调节及机制目的:探讨在急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后,通过干预自噬水平抑制EndMT进而减少心肌纤维化的的可行性。方法:取10周龄SD大鼠随机分为以下4组(1)Sham组:不对大鼠冠状动脉前降支进行结扎处理,余处理同AMI组;(2)AMI组:对大鼠冠状动脉前降支进行结扎处理;(3)AMI+rap(2 mg/kg/day):对大鼠冠状动脉前降支进行结扎处理,随即腹腔注射雷帕霉素,每天一次,持续14天;(4)AMI+3-MA(15 mg/kg/day):对大鼠冠状动脉前降支进行结扎处理,随即腹腔注射3-MA,每天一次,持续14天;分别对各组大鼠在各时间点进行如下实验:⑴心肌梗死14天后心脏彩超观察各组大鼠LVEF、LVFS、LVIDd及LVIDs变化并比较分析;⑵心肌梗死14天后Masson’s trichrome染色检测各组大鼠心肌胶原纤维化面积并比较分析;⑶心肌梗死7天后Western blot测定各组大鼠左室心肌梗死区域CD31、αSMA、COL1、LC3、beclin1的表达水平及比较分析;⑷心肌梗死7天后对左室心肌梗死区域双重免疫荧光染色观察CD31+αSMA+双阳性细胞及血管内皮细胞LC3的表达水平。结果:⑴大鼠心脏彩超结果显示:SD大鼠心肌梗死14天后,LVIDd、LVIDs扩大,LVEF、LVFS减低;雷帕霉素抑制心肌梗死后LVIDd、LVIDs的扩大及LVEF、LVFS减低(P0.05);3-MA并不能改善心肌梗死后心功能。⑵Masson’s trichrome染色结果显示:SD大鼠心肌梗死14天后,左室梗死区域纤维化显著;雷帕霉素显著减少心肌梗死后心肌纤维化面积;3-MA显著增加心肌梗死后心肌纤维化面积(P0.05)。⑶左室心肌梗死区域western blot结果显示:LC3-II在心肌梗死后1天内显著上升,而后表达逐渐减低;心肌梗死7天后,CD31表达下降,αSMA、COL1表达增加,LC3、beclin1未见明显改变;雷帕霉素增加了LC3及beclin1的表达,显著抑制了心肌梗死后的CD31表达下降和αSMA、COL1表达增加;3-MA降低了LC3及beclin1的表达,进一步促进了心肌梗死后的CD31表达下降和αSMA、COL1表达增加(P0.05)。⑷左室心肌梗死区域双重免疫荧光染色结果显示:CD31+/αSMA+双阳性细胞在心肌梗死后第7天明显上升,雷帕霉素可明显减少心肌梗死后CD31+/αSMA+双阳性细胞,3-MA可增加心肌梗死后CD31+/αSMA+双阳性细胞(P0.05);心肌梗死后CD31阳性内皮细胞LC3表达变化改变不明显,雷帕霉素可增加心肌梗死后CD31阳性内皮细胞LC3表达水平,3-MA可减低心肌梗死后CD31阳性内皮细胞LC3表达水平(P0.05)。结论:EndMT促进了心肌梗死后的心肌纤维化,而提高心肌梗死后的自噬水平可抑制EndMT,减轻心肌纤维化,改善心功能。
【图文】：

普通光学显微镜下HCMECs

标志物,内皮细胞

Control hypoxia图 2-1 普通光学显微镜下缺氧诱导的细胞形态学改变（100×）T-PCR比 Control 组，HCMECs 缺氧 3 天后内皮细胞标志物 CD31、E-
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】