基于藏象属性与干细胞分化的表观遗传学特性研究“中药归经”

发布时间：2020-06-07 06:40

【摘要】：目的:利用酶高效性和专一性特点,探讨甲基化酶与乙酰化酶系列,分析其相关表观遗传学特性。从全新的角度探索和验证中药归经理论的实质,初步探索中药归经评价体系客观化标准。方法:1、各组含药血清的采集与制备随机取SPF级雄性6-8w的SD大鼠9只,将制备好的归肝经的蒺藜、归肾经的蛇床子、归肝肾经的川续断三味中药的水煎剂,连续7天灌胃给大鼠,每天2次,每次灌胃后观察大鼠活动状态有无异常。灌胃第7日,即末次灌胃后在一定时间内(末次灌胃前12小时禁食不禁水)股动脉取血。再将装有股动脉血的真空采血管置于4℃冰箱2h,3000rpm/min离心15min,吸出上清液移入离心管,再放入56℃水浴锅30min以灭活补体,防止细胞毒,用0.22μm针式滤器过滤,制备好后密封放入零下80℃冰箱备用。2、骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定本实验选用全骨髓培养法,取SD大鼠,颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸泡3-5分钟。用碘伏棉球消毒皮肤,无菌条件下取出双侧完整的股骨和肱骨,置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织,剪断骨端,用抽取适量培养基的注射器插入骨内反复冲洗骨髓腔,直至骨发白,冲洗液直接收集在离心管中,离心5min(1500rpm/min),弃上清,加入新鲜的完全培养基(含10%FBS,1/100ml双抗溶液),接种于培养皿中,置于37℃、5%CO_2恒温培养箱中培养过夜。24h首次半量换液,3d全量换液,以后每2-3d换液1次,待细胞生长至约80%融合时,用0.25%胰蛋白酶溶液消化,按1:1比例常规传代。通过不断的更新培养基来进行纯化,进行形态学观察、绘制生长曲线,采用流式细胞仪对CD90、CD34、CD45表面抗原进行鉴定。3、各组归经含药血清对骨髓间充质干细胞的作用第3代BMSCs做细胞悬液,用血小球计数板进行细胞计数,调整细胞密度为1×10~6/ml,每孔500μl接种于24孔板。将细胞分为四大组:空白组、蒺藜组、蛇床子组和川续断组。药物组分为24h和72h两大组,每个药物组细胞再分为20%和10%两个高、低血清浓度组,空白组用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基正常培养。各组细胞置于37℃、5%CO_2恒温培养箱中分别培养24h和72h。4、不同归经药物对BMSCs的表观修饰相关基因表达影响采用q-RT-PCR法分别检测Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a、Hdac1对用药BMSCs作用24h和72h的mRNA表达量的影响。5、不同归经药物对脏器组织的表观修饰相关基因表达影响采用q-RT-PCR法分别检测Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a、Hdac1对肝脏、肾脏和脾脏的mRNA表达量的影响。结果:1、灌胃期间,三组大鼠精神充沛,活动灵便,饮食正常,皮毛整洁,体重增长良好,大便正常,各组大鼠均未出现死亡。2、刚分离的原代细胞悬浮于培养液中,大小不一,多数呈圆形或椭圆形,24h后可见部分细胞已经贴壁,呈纺锤形、多角形等多种形态,3d后细胞形成散在集落,细胞突起变长,长短不一,粗细不均。传代后的细胞生长速度明显加快,贴壁所用时间短,至2代后,细胞呈梭形,似成纤维样细胞,形态均一,呈漩涡状有序排列,可见少许悬浮细胞,换液后悬浮细胞消失。通过流式细胞仪鉴定第三代培养细胞,结果显示其细胞表面标志物CD90呈阳性表达,阳性表达率为94%;CD34和CD45均呈阴性表达,表达率分别为14.2%和1.1%。其结果说明了本实验室所用全骨髓培养法培养、纯化的BMSCs达到了要求。3、接种于24孔板的BMSCs,通过采用上述细胞用药的方法,观察细胞形态,发现用药24h后细胞形态依旧呈梭型,似成纤维细胞样,见少许悬浮细胞。用药72h后,细胞培养基稍许浑浊,见较多悬浮细胞。4、药物作用BMSCs 24h后,川续断高浓度组的Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a和Hdac1 mRNA相对表达量比其他药物组明显较高(P0.05),且Dnmt3a、Camkmt和Hdac1表达量大于1,说明其在药物作用BMSCs 24h中具有表达上调的趋势。药物作用BMSCs 72h后,蒺藜高浓度组的Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a和Hdac1 mRNA相对表达量比其他药物组较高(P0.05),且Camkmt和Kat2a表达量大于1,说明其在药物作用BMSCs 72h中具有表达上调的趋势。5、在肝组织中,蒺藜组的Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a和Hdac1 mRNA相对表达量明显高于其他药物组(P0.05),且Kdm1a和Kat2a表达量大于1,说明其在肝组织中具有表达上调的趋势。在肾组织中,蛇床子组的Camkmt mRNA相对表达量远远高于其他药物组,(P0.05),且表达量大于1,说明蛇床子组的Camkmt在肾组织中具有表达上调的趋势。而Dnmt3a、Kdm1a、Hdac1 mRNA相对表达量在各药物组中都相对较低,不具有统计学意义(P0.05)。在脾组织中,川续断组的Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a、Hdac1 mRNA相对表达量明显高于其他药物组(P0.05),且表达量均大于1,说明其在脾组织中具有表达上调的趋势。结论:1、本实验的骨髓间充质干细胞体外分离培养,采用了简单易操作的也是最为常用的全骨髓培养法,通过不断的更换新鲜培养基进行纯化,最后采用流式细胞仪鉴定细胞表面标志物,其结果与诸多文献报道结果一致,说明此方法能够分离培养出较为纯的骨髓间充质干细胞。2、从动物脏器上来看,归肝经的蒺藜对灌胃大鼠的肝脏中5种表观遗传酶mRNA的相对表达量均明显升高。说明归肝经药物集中影响,证明了中药归经理论的合理性。而归肝肾经的川续断在灌胃大鼠的脾脏中多种表观遗传酶具有表达上调的趋势,可能说明中药归经理论来源于古人的临床实践,通过观察药物的临床反应来判断药物疗效和归经,并不是单纯的中医脏腑与解剖脏器上的一一对应。3、从酶表观特性的结果来看,其在不同归经药物的作用下,发生了灵敏的表观遗传表达改变,说明其容易受到不同归经药物的影响,或许可作为中药归经评价体系客观化标准的候选基因。
【图文】：

形态图,形态,细胞的,细胞

成都中医药大学硕士学位论文部分细胞已经贴壁，呈纺锤形、多角形等多种形态，3d 后细胞形成散在集落，细胞突起变长，突起长短不一，粗细不均。传代后的细胞生长速度明显加快，贴壁所用时间短，至 2 代后，细胞呈梭形，似成纤维样细胞，形态均一，呈漩涡状有序排列，，可见少许悬浮细胞，换液后悬浮细胞消失。见图 2-1。

阴性,给药时间,药物血清,试剂盒

图 2-2：抗 CD90 阳性，抗 CD45 和抗 CD34 阴性BMSCs 增殖结果第 3 代 BMSCs，使用 CCK-8 试剂盒连续在同一时间检测 7d，按照 OD 值结长曲线图。见图:2-3。第 1 天比较，第 2-7 天均升高，其中检测第 2-4 天 BMSCs 增殖结果最为明液时间为 3 天，药物血清作用 BMSCs 的给药时间取 24h 和 72h 作为对照。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】