中药抗真菌方灌胃干预小鼠外阴阴道念珠菌感染的实验研究

发布时间：2020-06-07 07:25

【摘要】：目的:1.探讨中药抗真菌方有无抵御小鼠外阴阴道念珠菌感染的作用。2.观察中药抗真菌方对小鼠阴道局部TLR2、TLR4、IL-6、IL-10、IL-12表达的影响,为今后中医药防治外阴阴道念珠菌病研究提供新的方法与思路。方法:1.运用文献学的方法,收集整理古医籍治疗带下病的文献,经数据标准化处理后建立数据库。利用中医传承软件平台进行数据的录入与分析,对药物进行频数、聚类、关联规则的研究。从中分析古医籍治疗带下病的用药规律,寻找中药抗真菌方治疗外阴阴道念珠菌病的用药组方依据。2.将雌性BALB/c小鼠(8周龄)65只,体重20-25g,随机分为3组,分别是中药组、模型组和空白组,中药组和模型组每组各30只,空白组5只。模型组小鼠从第1天开始予生理盐水灌胃,持续至实验结束,第4天皮下注射含有0.1mg戊酸雌二醇的溶液0.1 ml,之后每一周注射一次。在第7天,模型组小鼠阴道内接种菌悬液100μl(含有白念珠菌14053孢子量10~8个)。中药组小鼠从第1天开始予中药抗真菌方灌胃,持续至实验结束,在第4天皮下注射含有0.1mg戊酸雌二醇的溶液0.1 ml,之后每一周注射一次。在第7天,中药组小鼠阴道内接种菌悬液100μl(含有白念珠菌14053孢子量10~8个)。空白组小鼠从第1天开始予生理盐水灌胃,持续至实验结束,第4天皮下注射含有0.1mg戊酸雌二醇的溶液0.1 ml。3.在第8d、9d、10d、12d和14 d、21d(即感染白念珠菌后第1d、2d、3d、5d、7d、14d)中药组和模型组每组各随机选取5只小鼠,麻醉后处死,采集阴道灌洗液及阴道组织。空白组小鼠在第8d将5只小鼠全部麻醉后处死,采集阴道灌洗液及阴道组织。4.用0.1ml含100单位蛋白酶抑制剂(complete,EDTA free)的无菌PBS缓冲液进行阴道灌洗。取阴道灌洗液40μl,稀释10-1000倍后,取稀释液100μl于酵母膏葡萄糖氯霉素琼脂培养基上涂布,37℃下培养24h。观察平板上菌落生长情况,进行菌落计数。5.将阴道灌洗液稀释后,使用ELISA试剂盒检测小鼠阴道灌洗液中IL-6、IL-10、IL-12表达的变化。6.每只小鼠采集的阴道组织分为两部分,一份采用实时荧光定量PCR检测小鼠阴道组织中TLR2和TLR4基因表达水平的变化。另一部分制作成蜡块标本,运用免疫组化染色检测小鼠阴道组织中TLR2和TLR4蛋白表达水平的变化。结果:1.菌落计数:模型组小鼠阴道灌洗液中菌落形成单味(CFU)出现一过性升高,在感染后第3天达到峰值,后逐渐下降,维持在一个低水平状态。中药组小鼠阴道灌洗液中CFU在感染后前3天未出现明显增加,其数值保持在一个稳定范围内,随后CFU数值逐渐下降。中药组小鼠阴道灌洗液中CFU值明显低于模型组。在感染后第3天、第5天、第7天、第14天时,两组小鼠阴道灌洗液中CFU差异有统计学意义(P0.05)。且在中药组小鼠中,感染后第3d有1例转阴,感染后第7d有2例转阴。空白对照组小鼠阴道灌洗液培养未发现白念珠菌。2.RT-PCR和免疫组化:TLR2和TLR4 mRNA相对表达量在模型组与中药组小鼠阴道组织中均有增加。模型组TLR2 mRNA表达增加后稳定在一个范围内,TLR4 mRNA表达出现一过性升高,在感染后第7天到达峰值,后开始下降。中药组TLR2 mRNA表达增加后也稳定在一个范围内,但是增长幅度明显大于模型组,在感染后第2-14天与模型组差异有统计学意义(P0.05)。中药组TLR4 mRNA表达在感染后第3天达到峰值,后逐渐下降,变化趋势与模型组相同,但是TLR4 mRNA的增长幅度大于模型组,两组数值在感染后第3天、第5天、第7天的差异有统计学意义(P0.05)。通过免疫组化方法比较后发现TLR2和TLR4蛋白的表达与mRNA表达的变化趋势相同。模型组与中药组的TLR2蛋白数值在感染后第1-7天的差异有统计学意义(P0.05),TLR4蛋白数值在感染后第1天、第3-14天的差异有统计学意义(P0.05)。TLR2和TLR4mRNA相对表达量与免疫组化结果呈正相关(P0.05)。3.细胞因子:模型组与中药组小鼠阴道灌洗液中IL-6浓度较空白组均出现增长,且随着时间推移逐渐增大。但是模型组与中药组小鼠阴道灌洗液的IL-6差异无统计学意义(P0.05)。模型组IL-12浓度从感染后第3天开始明显增加,于感染后第7天出现下降。中药组IL-12浓度低于模型组,在感染后第3天出现一过性增加,后开始下降。在感染后第3天、第5天、第7天模型组与中药组小鼠阴道灌洗液中IL-12差异有统计学意义(P0.05)。模型组与中药组小鼠阴道灌洗液中IL-10浓度较空白组均降低,下降后维持在稳定的较低水平范围内,在感染后第1天和第2天两组数据差异有统计学意义(P0.05)。TLR2 mRNA相对表达量与阴道微环境中IL-10浓度呈负相关(P0.05)。结论:1.中药抗真菌方有抵御小鼠阴道粘膜感染白念珠菌的作用,可以明显减少小鼠阴道中白念珠菌的数量。2.小鼠可以通过TLR2和TLR4调控阴道粘膜抵御白念珠菌的感染过程。小鼠阴道粘膜感染白念珠菌与阴道局部免疫IL-6、IL-10、IL-12失衡有关。3.中药抗真菌方通过TLR2和TLR4的信号通路干预念珠菌的感染。中药抗真菌方可能通过影响IL-10和IL-12的表达发生作用。4.TLR2信号通路的上调抑制IL-10的表达可能在小鼠阴道粘膜感染白念珠菌过程中起到重要作用。
【图文】：

医学免疫学）图 1.2.1 Th 细胞的分化及效应Fig.1.2.1 differentiation and effective of Th朗格汉斯细胞（Langerhans cells）是位于表皮和胃肠道上皮部位的未成熟DC。道粘膜下层中存在朗格汉斯细胞，可以提呈抗原，存在主要组织相容性复合体Ⅱ[57]。

S, 2004, Nat图 1.3.1 TLRs 结构示意图Fig. 1.3.1 Structure of TLRs 型跨膜蛋白，其结构可分为胞外区、跨膜区和胞内区由 16-28 个前后相连的片段组成，，每个片段包括 20
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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本文编号：2701068