通过玉屏风散效应成分的作用探索NLRP3调控IL-33的新机制

发布时间：2020-06-07 08:19

【摘要】：过敏反应或超敏反应是机体接触抗原物质或半抗原物质后引起的特殊免疫应答,属于变态反应中反应性过高的类型(I型变态反应),临床表现为肿、痒、疹、喘、流液等症状。呼吸系统、消化系统及皮肤由于广泛接触外来抗原,成为过敏性疾病的好发部位,包括支气管哮喘、消化系统变态反应、荨麻疹等[1]。玉屏风散(yu-ping-feng-san,YPFS)是益气固表的经典名方,由黄芪、白术、防风组成,在过敏性疾病中广泛应用[2]。课题组前期研究发现MC903诱导的小鼠皮炎模型中,NLRP3蛋白表达水平显著升高,同时引起上皮细胞分泌的关键促过敏因子IL-33的升高。玉屏风散可显著抑制MC903诱导的小鼠皮炎模型中NLRP3、IL-33的表达,因此提示NLRP3与IL-33之间可能具有相关性。本论文进一步对玉屏风散效应成分影响NLRP3与IL-33的作用进行研究,并探索过敏性疾病中NLRP3与IL-33的作用关系及机制。本研究主要从以下四个方面进行探讨。1.玉屏风散效应成分体内外对NLRP3、IL-33的影响在MC903诱导的小鼠特异性皮炎模型上,分别给予玉屏风散效应成分毛蕊异黄酮、芒柄花素、升麻素,考察其对小鼠特异性皮炎模型的影响,包括耳肿胀度、炎性浸润、促炎细胞因子水平以及NLRP3、IL-33表达水平。结果发现,芒柄花素可有效抑制MC903引起的耳肿胀、炎性浸润,同时降低IgE、IL-33分泌水平,并可明显减少NLRP3、IL-33的表达。体外建立NLRP3高表达模型,HaCaT细胞上分别给予过敏原MC903、FITC以及促炎刺激因子LPS和氧化应激产物ATP刺激,检测NLRP3、IL-33的蛋白表达水平;在体外建立的NLRP3高表达模型中,分别应用玉屏风散提取物及其效应成分毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪-甲苷、升麻素,检测其对NLRP3、IL-33的作用。结果表明1)LPS联合ATP刺激HaCaT细胞,可显著升高NLRP3、IL-33的表达;2)芒柄花素抑制NLRP3、IL-33表达作用最为明显。上述体内外研究结果可见,玉屏风散效应成分在影响IL-33的同时,也可影响NLRP3的表达,提示NLRP3与IL-33可能存在一定的关联。2.NLRP3调控IL-33的关系确认在体外建立的NLRP3高表达模型中,分别转染NLRP3 siRNA和IL-33 siRNA,以及NLRP3过表达质粒,检测NLRP3、IL-33的蛋白表达水平,确证NLRP3与IL-33作用上下游关系;并在人支气管上皮细胞(16HBE)中对NLRP3、IL-33作用关系进行探究。结果发现在上皮细胞中,过表达NLRP3可显著升高IL-33表达,沉默NLRP3可显著降低IL-33表达,而沉默IL-33对NLRP3表达未见明显影响。可见NLRP3能促进IL-33的表达。3.IRF4参与NLRP3调控IL-33作用在HaCaT细胞中检测IL-33相关转录因子(p-NF-κB、p-STAT3、AP-1、IRF3、IRF4、IRF7)蛋白表达水平或基因表达水平;在HaCaT/16HBE细胞中分别转染IRF4 siRNA和IRF4过表达质粒,检测IRF4对NLRP3、IL-33蛋白表达水平的影响;在HaCaT细胞中进行免疫共沉淀实验,检测IRF4与NLRP3的蛋白相互作用。结果发现1)IRF4在NLRP3高表达模型中蛋白和基因水平均显著性升高;2)过表达IRF4可显著升高NLRP3、IL-33表达,沉默IRF4可明显降低NLRP3、IL-33表达;3)IRF4与NLRP3存在蛋白互作。可见IRF4参与NLRP3调控IL-33作用,且可能与二者蛋白的结合有关。4.NLRP3调控IL-33作用机制探索分别提取HaCaT细胞的胞浆蛋白和胞核蛋白,检测NLRP3蛋白在胞内的表达分布情况;染色质免疫共沉淀实验检测NLRP3蛋白与IL-33DNA结合情况;酵母单杂交实验检测IRF4/NLRP3蛋白与IL-33启动子结合情况;在MC903诱导的小鼠特异性皮炎模型上,分别给予ASC寡聚抑制剂—MCC950和Caspase-1活性抑制剂—VX-765,考察其对小鼠特异性皮炎模型的影响,包括耳肿胀度、炎性浸润、促炎细胞因子水平以及NLRP3、IL-33表达水平。结果发现1)NLRP3主要表达于上皮细胞的胞核内;2)NLRP3蛋白与IL-33启动子DNA序列存在结合;3)NLRP3炎症小体复合物中的ASC寡聚以及Caspase-1活化对NLRP3调控IL-33作用未见明显影响。这提示NLRP3调控IL-33主要与其转录功能有关,而不依赖经典炎症小体途径。研究结论:1.玉屏风散效应成分芒柄花素可显著抑制因MC903引起的小鼠耳肿胀、炎性浸润以及耳组织中NLRP3、IL-33表达水平,体外芒柄花素也可有效抑制NLRP3、IL-33的表达;2.NLRP3不依赖经典炎症小体途径调控IL-33表达,而是通过与IL-33启动子DNA序列结合发挥转录调节作用;NLRP3调控IL-33作用受IRF4的影响。
【图文】：

细胞,情况,避光,荧光淬灭

ＰＢＳ洗涤细胞（５邋ｍｉｎ／次，３次），０．２％邋Ｔｒｉｔｏｎ－１００破膜，ｏｎ－１００，邋ＰＢＳ邋洗涤细胞（５邋ｍｉｎ／次，３邋次），１．５％邋ＢＳＡ，封闭，室，邋ＰＢＳ洗涤细胞（５邋ｍｉｎ／次，３次），结合相应一抗，４邋°Ｃ，过夜；，，ＰＢＳ洗涤细胞（１０邋ｍｉｎ／次，３次），结合相应二抗，避光，室，ＰＢＳ洗涤细胞（１０邋ｍｉｎ／次，３次），０．２％ＤＡＰＩ染核，避光，室温，１ＰＩ，ＰＢＳ洗涤细胞（１０邋ｍｉｎ／次，３次），抗荧光淬灭剂铺于玻底，Ｐ刺激ＨａＣａＴ细胞对ＮＬＲＰ３、ＩＬ－３３胞内分布的影响。逡逑／ｍＬ）联合ＡＴＰ邋（５邋ｍＭ）刺激ＨａＣａＴ细胞，提取胞浆蛋白和胞，ＮＬＲＰ３在细胞内分布明显增多，且主要分布在细胞核内，ＩＬ－表达。免疫荧光结果同样显示：ＮＬＲＰ３主要分布在ＨａＣａＴ细明显增多。逡逑ｕｃｅｕｓｔｏｌａｓｍ逡逑
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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