基于脉络学说探讨内皮间质转分化在AMI后心肌纤维化中的病理机制及通络干预研究

发布时间：2020-06-07 20:45

【摘要】：本研究以中医脉络学说为指导,基于《灵枢·百病始生》言“虚邪之中人也,始于皮肤,……留著于脉,稽留而不去,息而成积,或著孙脉,或著络脉”的论述,提出急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)后心肌纤维化的基本病机为“气虚血瘀,络阻积成”,并确立“益气活血,通络消积”的基本治法。以内皮间质转分化(Endothelial-to-mesenchymal transition,End MT)为切入点,分别通过建立SD大鼠AMI后心肌纤维化模型和缺氧诱导人心脏微血管内皮细胞(Human Cardiac Microvascular Endothelial Cells,HCMECs)致End MT模型,给予代表性通络药物通心络为干预,不仅有助于揭示AMI后心肌纤维化中的病理机制,对于阐明通心络基于“微血管”保护,调控神经调节蛋白-1(neuregulin-1,NRG-1)介导End MT在AMI心肌纤维化中的作用机制也具有重要意义。第一部分内皮间质转分化在AMI后心肌纤维化中的作用及通络干预研究目的:观察End MT在AMI后心肌纤维化中的作用,并揭示通心络的干预作用。方法:以SD大鼠为研究对象,结扎SD大鼠冠状动脉前降支以建立AMI模型,根据结扎前后心电图ST段变化来评价AMI模型是否建立成功。术后将造模成功的SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、通心络低剂量组(TXL-L)、通心络中剂量组(TXL-M)、通心络高剂量组(TXL-H)和贝那普利组(Benazepril),每组各10只。于造模次日给予药物干预,实验前用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液将药物配成所需浓度,给药剂量分别为:TXL-L 0.2g/kg/d、TXL-M0.4g/kg/d、TXL-H 0.8g/kg/d、Benazepril 10mg/kg/d,灌胃体积均为3m L/kg。灌胃给药4周后,小动物超声仪评价心功能;称取心脏重量、记录并计算大鼠心重指数(HW/BW);Masson染色方法检测大鼠心肌纤维化程度;Western Blot方法检测Collagen I、CollagenⅢ、MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平,通过以上方法评价通心络对AMI后心肌纤维化的作用;Western Blot和RT-q PCR方法检测End MT相关标记物CD31、VE-cadherin、α-SMA和FSP-1在蛋白和m RNA表达水平上的变化,揭示End MT在AMI后心肌纤维化中的作用。结果:1冠状动脉结扎前后心电图变化结扎左冠状动脉前降支前,P波及PR间期明显,R波降支与T波升支相交,无明显ST段;结扎左冠状动脉前降支后,R波与T波之间融合为高大的帐篷状波,出现“损伤型”ST段改变,表明大鼠AMI模型制备成功。2通心络改善AMI后心肌纤维化大鼠心功能给药4周后,利用小动物超声仪检测AMI后大鼠的心功能,与Sham组相比,Model组心功能明显下降,LVEDd和LVESd水平升高,EF和FS水平下降(P0.01);与Model组相比,TXL-L对心功能的保护作用没有显著影响(P0.05),TXL-M、TXL-H和Benazepril对AMI诱导的心功能变化具有明显改善作用,降低LVEDd、LVESd水平,显著增加EF、FS水平(P0.01);与Benazepril组相比,TXL-H对心功能的保护作用无显著性差异(P0.05)。3通心络降低AMI后心肌纤维化大鼠HW/BW指数称取心脏重量并记录,计算心重指数=心脏重量/体重(HW/BW)。结果显示与Sham组相比,Model组大鼠的心重指数显著升高(P0.01);药物干预4周后,与Model组相比,TXL各剂量组和阳性对照药Benazepril组心重指数显著降低(P0.01);与Benazepril组相比,TXL各剂量组降低HW/BW指数的作用无显著性差异(P0.05)。4通心络改善SD大鼠AMI后心肌纤维化应用Masson三色染色检测心肌纤维化,蓝色代表胶原纤维,红色代表心肌。Sham组心肌组织纤维排列紧密有序,无明显胶原纤维增生;Model组心肌纤维排列无序,大量胶原纤维增生;TXL各剂量和Benazepril干预后可不同程度地改善心肌纤维化。应用Western Blot方法检测I型和III型Collagen,MMP-2,MMP-9蛋白表达。与Sham组相比,Model组Collagen I、Collagen III、MMP-2和MMP-9蛋白表达量显著上调,差异有统计学意义(P0.01);与Model组相比,TXL各剂量和Benazepril干预的AMI大鼠Collagen I、Collagen III、MMP-2和MMP-9蛋白显著下调(P0.05,P0.01),与Benazepril组相比,TXL-H下调上述蛋白的作用无显著性差异(P0.05),通心络剂量依赖性地减轻AMI后心肌纤维化。5通心络抑制AMI后心肌纤维化大鼠End MT与Sham组相比,Model组内皮细胞标记物CD31、VE-cadherin蛋白和m RNA水平表达均下调,而间质细胞标记物α-SMA、FSP-1的表达水平均上调(P0.01),表明End MT参与调控AMI后心肌纤维化的进程;与Model组相比,TXL各剂量组和Benazepril组能够不同程度上调AMI大鼠内皮细胞标记物CD31、VE-cadherin蛋白和m RNA水平的表达,下调间质细胞标记物α-SMA、FSP-1蛋白和m RNA水平上的表达(P0.05,P0.01);与Benazepril组相比,TXL-H对于AMI后End MT的抑制作用无显著差异(P0.05),表明TXL能够抑制AMI后心肌纤维化大鼠End MT进程。第二部分缺氧诱导HCMECs致内皮间质转分化的作用及通络干预研究目的:从离体细胞水平观察缺氧诱导HCMECs发生End MT的作用,并揭示通心络对End MT的干预作用。方法:将HCMECs细胞置于1%O2的37℃缺氧培养箱中培养3天以构建End MT模型。具体分为Control组、Hypoxia组、TXL组。MTS比色法检测TXL对HCMECs细胞生存活性的影响;Western Blot方法检测细胞End MT相关标记物CD31、VE-cadherin、α-SMA和FSP-1蛋白表达水平变化;FITC Phalloidin标记的鬼笔环肽检测HCMECs细胞F-actin蛋白变化;免疫荧光法检测HCMECs细胞End MT相关标记物CD31、v WF、α-SMA和Vimentin表达。结果:1 MTS比色法检测通心络对HCMECs生存活性的影响TXL对HCMECs具有保护作用。TXL 200μg/m L组的生存活性值与Control组相比,虽无显著差异(P0.05),但其呈上升趋势;TXL 400μg/m L和600μg/m L对HCMECs具有促增殖作用(P0.01),在600μg/m L时显著性最明显。2通心络抑制缺氧诱导HCMECs细胞发生End MT Western Blot方法检测TXL对缺氧诱导HCMECs细胞End MT相关因子的影响,分别以TXL 600μg/m L,400μg/m L和200μg/m L进行干预,结果显示缺氧诱导间质细胞标记物α-SMA和FSP-1蛋白表达上调,而降低了HCMECs标记物CD31和VE-cadherin蛋白表达(P0.01);TXL各剂量组能够不同程度地抑制缺氧诱导的End MT,包括上调CD31和VE-cadherin蛋白表达,下调α-SMA和FSP-1蛋白表达(P0.05,P0.01),其抑制作用且呈剂量依赖性,TXL 600μg/m L效果最佳。FITC Phalloidin标记的鬼笔环肽检测结果显示,Control组HCMECs呈鹅卵石形态,F-actin呈细丝状分布均匀,缺氧能够诱导HCMECs由鹅卵石形态转化为梭形,F-actin聚集成束,表达大量的应力纤维,应用TXL600μg/m L进行干预,通心络能够改善由缺氧引起的细胞形态和F-actin的变化。应用免疫荧光方法检测TXL对缺氧诱导End MT的影响,结果显示Control组HCMECs呈典型的鹅卵石形态,当暴露于缺氧条件时,HCMECs失去其原有特征,呈现分散的纺锤形外观。HCMECs细胞标记物CD31和v WF蛋白表达下调,间质细胞标记物α-SMA和Vimentin蛋白表达上调,给予TXL干预后CD31和v WF蛋白表达上调,α-SMA和Vimentin蛋白表达下调,表明TXL对缺氧诱导HCMECs发生的End MT具有抑制作用,这与体内实验中通心络抑制AMI大鼠End MT的研究结果相一致。第三部分NRG-1/Erb B/PI3K/AKT信号通路在内皮间质转分化中的作用及通络干预研究目的:揭示NRG-1/Erb B/PI3K/AKT信号通路是否参与End MT介导的AMI后心肌纤维化,进一步从离体细胞水平探讨NRG-1/Erb B/PI3K/AKT通路在缺氧诱导HCMECs致End MT中的作用,并评价通心络对End MT的干预作用及机制。方法:整体动物实验:模型制备及给药方法同第一部分,给药4周后,Western Blot方法检测信号通路上下游因子:NRG-1、p-Erb B2、p-Erb B4、PI3K、p-AKT和snail的蛋白表达,以探讨NRG-1/Erb B/PI3K/AKT信号通路是否参与End MT介导的AMI后心肌纤维化。离体细胞实验:将HCMECs细胞置于1%O2的37℃缺氧培养箱培养3天以构建End MT模型。(1)将细胞分为Control组和Hypoxia组,Western Blot方法检测缺氧对HCMECs中NRG-1蛋白表达水平的影响;(2)流式细胞仪和Western Blot方法确定NRG-1 si RNA对HCMECs细胞NRG-1基因的最佳沉默条件;(3)将细胞分为Control组和si RNA NRG-1组,Western Blot方法检测End MT标记物及NRG-1/Erb B/PI3K/AKT通路上下游因子蛋白表达;(4)为进一步探讨通心络抑制End MT的具体分子机制,将实验分组为:Control组、Hypoxia组、Hypoxia+si RNA NRG-1组、Hypoxia+TXL组和Hypoxia+si RNA NRG-1+TXL组,采用免疫荧光方法检测HCMECs细胞End MT相关标记物v WF和Vimentin表达情况;Western Blot方法检测End MT相关标记物及信号通路上下游因子HIF-1α、NRG-1、p-Erb B2、p-Erb B4、p-AKT和snail的蛋白表达。结果:1通心络激活AMI后心肌纤维化大鼠NRG-1/Erb B/PI3K/AKT通路与Sham组比较,Model组NRG-1、p-Erb B2、p-Erb B4、PI3K和p-AKT蛋白表达下调,End MT转录因子snail蛋白表达水平显著上调(P0.01);与Model组比较,TXL各剂量组和Benazepril能够不同程度上调心肌纤维化组织中NRG-1、p-Erb B2、p-Erb B4、PI3K和p-AKT蛋白表达,下调snail蛋白表达(P0.05,P0.01);与Benazepril组相比,TXL-H对上述蛋白的上调作用无显著差异(P0.05)。提示NRG-1/Erb B/PI3K/AKT通路参与AMI后心肌纤维化,TXL可能通过激活NRG-1/Erb B/PI3K/AKT通路,而发挥抑制AMI后心肌纤维化大鼠End MT的作用。2缺氧诱导HCMECs细胞NRG-1蛋白水平下调将HCMECs置于缺氧培养箱构建End MT模型,Western Blot方法检测NRG-1蛋白表达情况。与Control相比,缺氧显著下调NRG-1蛋白表达水平(P0.01),与动物实验AMI后NRG-1蛋白表达水平下调的结果相一致。3小干扰RNA对HCMECs细胞NRG-1基因的最佳沉默条件为明确NRG-1是否以负反馈方式参与缺氧诱导End MT,应用si RNA NRG-1沉默HCMEC中NRG-1基因,流式细胞仪检测三种NRG-1 si RNA对HCMECs的转染率,结果显示si RNA-1626的转染率高;Western Blot方法检测si RNA NRG-1对HCMECs中NRG-1蛋白的沉默作用,结果显示si RNA-1626对NRG-1表达具有显著的沉默作用(P0.01)。4沉默NRG-1基因促进HCMECs细胞发生End MT Western Blot方法检测End MT标记物蛋白表达,与Control组相比,si RNA NRG-1组HCMECs细胞标记物CD31和VE-cadherin的蛋白表达水平下调,间质标记物α-SMA和FSP-1的蛋白表达水平上调(P0.01),证实体外应用si RNA NRG-1沉默NRG-1基因表达促进HCMECs细胞发生End MT。5沉默NRG-1基因抑制NRG-1/Erb B/PI3K/AKT通路体外应用NRG-1 si RNA预处理HCMECs以沉默NRG-1基因表达,Western Blot方法检测NRG-1/Erb B/PI3K/AKT通路上下游关键因子的蛋白表达,与Control组相较,si RNA NRG-1组NRG-1、p-Erb B2、p-Erb B4和p-AKT蛋白水平显著降低(P0.01),表明si RNA NRG-1抑制NRG-1/Erb B/PI3K/AKT通路激活。6通心络通过激活NRG-1/Erb B/PI3K/AKT通路抑制缺氧诱导HCMECs细胞发生End MT6.1通心络激活HCMECs细胞NRG-1/Erb B/PI3K/AKT信号通路与Control组相比,Hypoxia组HIF-1α蛋白表达显著上调,NRG-1、p-Erb B2、p-Erb B4和p-AKT蛋白水平下调,End MT转录因子snail蛋白表达水平上调(P0.01);与Hypoxia组相比,Hypoxia+TXL组NRG-1、p-Erb B2、p-Erb B4和p-AKT的蛋白水平显著上调,HIF-1α和snail蛋白表达水平下调(P0.05,P0.01),提示TXL能够激活HCMECs细胞的NRG-1/Erb B/PI3K/AKT信号通路;与Hypoxia+TXL组相比,Hypoxia+TXL+si RNA NRG-1组HIF-1α蛋白表达上调,NRG-1、p-Erb B2、p-Erb B4和p-AKT蛋白水平下调,snail蛋白水平上调(P0.05,P0.01);与Hypoxia+si RNA NRG-1组相比,Hypoxia+TXL+si RNA NRG-1组HIF-1α和snail蛋白表达下调,p-AKT蛋白表达上调(P0.05,P0.01)。表明应用si RNA NRG-1能够部分逆转TXL对NRG-1/Erb B/PI3K/AKT信号级联的激活作用,逆转TXL对snail的抑制作用。6.2通心络通过激活NRG-1/Erb B/PI3K/AKT通路抑制End MT免疫荧光染色结果显示,Hypoxia组HCMEC标记物v WF蛋白表达减少,间质细胞标记物α-SMA蛋白表达增加;应用Hypoxia+TXL处理能够增加v WF蛋白表达,减少α-SMA蛋白表达;而TXL+si RNA NRG-1能够显著抑制v WF蛋白表达,增加α-SMA蛋白表达。Western Blot方法检测End MT标记物蛋白表达,结果显示,与Control组相比,Hypoxia组HCMECs标记物CD31和VE-cadherin蛋白水平表达下调,间质标记物α-SMA、FSP-1和Vimentin蛋白水平表达上调(P0.01);与Hypoxia组相比,Hypoxia+TXL组CD31和VE-cadherin蛋白表达上调,α-SMA、FSP-1和Vimentin蛋白表达下调(P0.01);与Hypoxia+TXL组相比,Hypoxia+TXL+si RNA NRG-1组CD31、VE-cadherin蛋白表达下调,α-SMA、FSP-1和Vimentin蛋白水平表达上调(P0.05,P0.01);与Hypoxia+si RNA NRG-1组相比,Hypoxia+TXL+si RNA NRG-1组CD31、VE-cadherin蛋白表达上调,α-SMA、FSP-1和Vimentin蛋白表达下调(P0.05,P0.01),提示NRG-1/Erb B/PI3K/AKT信号级联参与TXL对HCMEC的保护作用。结论:1本研究以中医脉络学说为指导,提出AMI后心肌纤维化的基本病机为“气虚血瘀,络阻积成”,与AMI后“微血管”损伤介导的心肌纤维化的过程具有内在相关性,并确立“益气活血,通络消积”的基本治法,开辟了以End MT为切入点阻抑AMI后心肌纤维化的有效治疗途径。2围绕NRG-1介导的End MT在AMI后心肌纤维化中的病理机制进行研究,分别通过建立SD大鼠AMI后心肌纤维化模型和缺氧诱导HCMECs致End MT模型,从整体动物水平和离体细胞水平揭示了End MT是AMI后心肌纤维化的关键病理环节,NRG-1/Erb B/PI3K/AKT通路参与End MT介导的AMI后心肌纤维化病程。3以通络代表方药通心络进行干预,在整体动物水平其能够改善心功能、抑制AMI后心肌纤维化及End MT病程。在离体细胞水平通心络能够保护微血管内皮的结构完整性,通过激活NRG-1/Erb B/PI3K/AKT信号通路,抑制缺氧诱导HCMECs发生End MT。本研究结合实验数据验证“气虚血瘀,络阻积成”的病机假说,为脉络学说指导的“益气活血,通络消积”治法提供科学数据和佐证。
【图文】：

心电图,冠状动脉结扎,心电图

附图ECG before the left coronary artery ligationECG after the left coronary artery ligation

纤维化

37图 1-4 Masson 染色检测 AMI 后大鼠心肌纤维化 Myocardial fibrosis was detected by Masson trichro Sham group:**P<0.01; vs Model group:##P<0.01; vgroup:&&P <0.01
【学位授予单位】：河北中医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】