【摘要】：随着人们生活方式改变、饮食结构变化、生活节奏加快以及生存环境的恶化,神经系相关的疾病,如疲劳、中风、抑郁症及免疫低下等发病率逐渐增加,严重影响了人们的身体健康及生存寿命。因此,亟待开发针对神经系统疾病的、具有有效低毒的药用食品或佐剂。沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是我国特色的传统药用食品,具有多种药效学活性。西藏药典 晶珠本草‖中具有提神醒脑、抗缺氧等调节神经系统的相关作用。而多糖是沙棘中含量最多的特色成分,目前,关于沙棘多糖调节神经系统作用及其机制,尚无系统的研究报道。本文从沙棘果实中分离获得沙棘多糖,在细胞和动物水平上讨沙棘多糖级分的神经保护作用及机制述,以推动其在相关临床医药领域的深入开发和应用。首先,本文以沙棘果实为材料,按照青海省中科院实验室建立的的方法进行了分离:经过水提、醇沉及DEAE-纤维素离子交换层析纯化得到沙棘总糖HRWP。再将HRWP经DEAE-纤维素离子交换柱分级,获得HRWP-N及HRWP-A。HRWP-N为中性的HG型果胶,而HRWP-A为高甲基化的酸性HG型果胶级分。将HRWP、HRWP-N及HRWP-A给予小鼠给药,探讨其对于抗抑郁、抗脑肿瘤及抗中风等神经系统相关疾病,并比较分析其活性较好的活性单元。研究通过开场实验OFT、游泳模型FST及慢性不可预见性模型CUMS模型探讨沙棘多糖抗抑郁活性。首先采用FST模型分析,体内口服给药方式给药小鼠沙棘总多糖HRWP(50,100和200 mg/kg),每天一次,共15天。结果显示沙棘水溶性总多糖HRWP能够减少小鼠的不动时间推测其具有抗抑郁样的效果,并且该效果与神经兴奋性无关;同时,沙棘多糖对于FST小鼠的体重无显著影响,但对抑郁样状态导致的肝脏重量降低有一定恢复作用。然后使用FST再进一步分析其抗抑郁作用较好的活性级分。对于沙棘多糖抗抑郁活性级分单元的分析显示:HRWP-A能够显著提高FST小鼠的不动时间,其效果优于HRWP-N及HRWP。进一步,通过开场实验OFT及慢性不可预见性模型CUMS探讨HRWP-A对抑郁模型小鼠的恢复作用,并分析HRWP-A对CUMS小鼠神经递质及氧化应激分子等的影响。结果显示HRWP-A可抑制CUMS诱导的自主活动降低等抑郁样状态。同时,HRWP一定程度上抑制了FST诱导的葡萄糖(GLU),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的减少以及肌酸磷酸激酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH),甘油三酯(TG)和丙二醛(MDA)的增加。ELISA结果显示HRWP-A还上调CUMS小鼠脑神经递质5羟色胺(5-HT)及多巴胺(DA)的水平。HRWP-A可上调CUMS小鼠海马BDNF(brain derived neurotrophic factor)及pCREB(环磷腺苷效应元件结合蛋白)。提示HRWP-A抗抑郁样效果的机制涉及到抗氧化及维持脑内神经递质稳态及上调BDNF-CREB通路。采用小鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)诱导的局灶性脑缺血模型,探讨HRWP-A对中风的保护作用及其机制。小鼠接受HRWP-A(50,100和200 mg/kg)。持续14天,然后进行右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)后再灌胃给予HRWP-A 2天。第三天安乐处死小鼠后,通过分析TTC实验分析MCAO小鼠的脑梗塞面积;神经学严重程度评分(mNSS),转角测试和触须引发的前肢放置测试mNSS行为学评分评估其行为学;通过分析脑组织及血清中的氧化应激分子及细胞因子分析HRWP-A发挥小鼠中风保护作用的机制。结果显示,HRWP-A显著降低梗死面积并改善MCAO小鼠的神经功能障碍。HRWP-A改善了神经保护状态,因为它可以抑制MCAO小鼠MDA和NO的增加,同时减少脑中SOD,过氧化氢酶(CAT)和GPx水平的降低。同时,HRWP-A降低了血清中促炎指标TNF-α,IL-1β和IL-6的水平。该过程伴随着NLRP3及MMP9表达的下调,同时上调claudin-5的表达。HRWP-A引起脑损伤的改善。HRWP-A的神经保护性质为其在药用食品的开发及其用于潜在神经保护的应用提供了证据。通过体外研究判断HRWP-A对Lewis肺癌,LLC;人胶质瘤细胞细胞,U87;小鼠胶质瘤细胞,GL261;人乳腺癌细胞,231等细胞无直接的增殖抑制作用。采用Lewis肺癌(LLC)荷瘤小鼠,对HRWP-A的抗肿瘤活性进行预实验,发现HRWP-A具有显著抑制LLC-荷瘤小鼠的肿瘤生长的作用,其效果优于总糖HRWP。然后,通过小鼠脑胶质瘤(GL-261)原位模型进行研究,结果表明HRWP-A可延长荷瘤小鼠的生存期。质谱流式仪对其原位肿瘤微环境中免疫细胞的数量进行了分析,结果显示:HRWP-A组对肿瘤原位微环境中的单核细胞数量较模型组显著增加;而对的肿瘤局部的Treg、CD8+T、CD4+T及cDC的数量无显著影响。单核细胞到达组织后分化为巨噬细胞,因而进一步,探讨了HRWP-A是否对小鼠巨噬细胞具有直接作用。分离小鼠腹腔巨噬细胞,qPCR及western blot分析结果显示HRWP-A在体外上调巨噬细胞表面TLR4的表达;该过程伴随着MyD88表达和pIκB-α的明显增加,而TLR4抗体预处理可在很大程度上消除这种效果。HRWP-A对巨噬细胞产生NO,IL-1β和IL-6的影响也被TLR4抗体及PDTC(NF-κB抑制剂)所抑制。此外,HRWP-A未能诱导C3H/HeJ(Tlr4基因突变)鼠来源腹腔巨噬细胞中NO,IL-1β和IL-6的产生,以上结果表明TLR4分子参与HRWP-A介导的巨噬细胞活化。这些结果对于理解药用植物多糖对脑胶质瘤生长抑制的免疫调节有重要意义。本研究对沙棘活性中心化合物进行筛选后,探讨沙棘多糖活性单元对神经系统疾病的药效活性,为多糖的构效关系研究提供依据,并为神经系统疾病的新药及辅助药开发提供行业发展所需的基础数据支持;同时对沙棘多糖影响神经系统保护机制进行的研究,有助于理解神经系统疾病的发病机制及影响因素。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
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