基于转录组学和靶点数据库的五味子乙素抗肝纤维化作用相关分子机制研究

发布时间：2020-06-09 14:47

【摘要】：肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)是肝脏对各种病因所致慢性肝损伤的修复反应,是慢性肝病共有的病理改变,主要特征是以胶原为主的细胞外基质(Extra cellular matrix,ECM)在肝内的过度沉积,导致肝脏结构改变和肝功能丧失。虽然近年来肝纤维化病理机制研究已取得很大进展,但是肝纤维化发病机制尚未阐明,临床上仍缺乏有效的抗肝纤维化药物。因此,寻找有效的抗肝纤维化药物和阐明其确切作用机制具有重要的理论意义和临床价值。五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)是木兰科植物五味子中主要的木脂素类成分,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤及保肝等多种药理学活性。近期研究发现,五味子乙素在体外不仅可以抑制TGF-β诱导的纤维化信号通路,还可以诱导肝星状细胞的凋亡。然而,其在体内的抗肝纤维化作用及其作用机制研究却未见报道。因此,在本研究中,首先通过构建CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型评价五味子乙素抗肝纤维化作用效果。然后,采用基于RNA-seq的转录组学方法在基因水平上探讨五味子乙素抗肝纤维化作用可能的分子机制。随后,根据转录组学的结果,进一步采用分子生物学技术对肝纤维化发生、发展过程中的关键生物学过程和信号通路进行研究,进一步对五味子乙素抗肝纤维化作用的分子机制进行验证和补充。最后,通过构建肝纤维化疾病靶点数据库,采用在线高通量、快速的“成分-靶点”对接分析,虚拟筛选五味子乙素可能的生物学靶点。在此基础上,结合表面等离子体共振和放射性竞争性结合实验从亲和力的角度对这些作用靶点进行验证,从而在分子靶点层面阐明五味子乙素抗肝纤维化作用的分子机制。药理作用评价结果显示,五味子乙素显著的减轻了CCl4诱导的肝纤维化。生化检测结果表明,五味子乙素显著降低了ALT、AST和Hyp含量,病理切片HE、Masson和Sirius Red染色表明五味子乙素明显减轻了肝细胞坏死和胶原纤维化的沉积。此外,我们还采用免疫组化和Western Blot的方法检测肝纤维化主要评价指标α-SMA和Collagen-I的表达水平,结果显示五味子乙素可以降低其表达水平,这些实验结果均说明五味子乙素具有良好的抗肝纤维化作用。在此基础上,采用高通量测序的方法对其进行全转录组测序,结果显示五味子乙素组与肝纤维化模型组相比上调的基因数为2584个,表达下调的基因数为1659个。通过GO和Pathway分析,发现五味子乙素主要影响了氧化还原过程、CCl4的代谢、肝脏的炎症反应和细胞凋亡等生物学过程。为了验证这些生物学过程,我们首先通过检测氧化应激的相关指标,结果显示五味子乙素降低了肝纤维化模型大鼠中MDA的含量,提高了SOD和GSH-PX的活性,表明五味子乙素减轻CCl4诱导的氧化应激过程。炎症反应是肝纤维化重要的病理过程,通过Real time-PCR检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6及TGF-β的表达水平,结果显示炎症因子的表达水平也被降低了。此外,TUNEL实验证明了五味子乙素显著减轻了CCl4诱导的细胞凋亡。由于肝星状细胞的活化是肝纤维化发生的关键环节,因此在体外,我们重点研究了五味子乙素对肝星状细胞增殖、活化的影响。实验结果显示,五味子乙素可以抑制TGF-β刺激的肝星状细胞活化。随后,对TGF-β引起的信号通路进行研究,我们发现五味子乙素主要是影响了TGF-β/Smad和MAPK通路。最后,为了阐释五味子乙素抗肝纤维化作用的生物学靶点,采用化学信息学的方法构建肝纤维化疾病靶点数据库,采用高通量对接软件,虚拟筛选潜在的生物学靶点。在此基础上,进一步通过放射性竞争性结合实验发现CB2受体有可能为其作用的靶点。综上,五味子乙素有效的改善了CCl4诱导的大鼠肝纤维化,采用转录组学的方法在基因水平上研究五味子乙素发挥抗肝纤维化作用的关键基因及其相关的生物学网络。根据转录组学的结果,对肝纤维化发生、发展过程中关键环节进行了研究,进一步阐释了五味子乙素抗肝纤维化的作用机制。最后,通过化学信息学的方法寻找五味子乙素可能的作用靶点,并通过放射性竞争性结合实验进行验证,发现其作用的靶点有可能为CB2受体。该研究结果一方面表明五味子乙素具有保肝、抗纤维化等作用,另一方面从信号通路和生物学靶点的角度阐释了其抗肝纤维化的分子机制,为后期的新药开发和临床应用提供了实验支持和理论依据。此外,本论文采用的研究思路和方法,也为寻找治疗其它复杂疾病药物的靶标提供了方法,具有一定的借鉴意义。
【图文】：

肝纤维化,炎症反应,微环境,基质金属蛋白酶

图 0- 1 肝纤维化发病机制（Chem Biol Interact. 2011 Sep 30;193(3):225-31）大量基础和临床研究证实，炎症反应伴随着各种肝脏疾病，是其必有的过程，也是肝脏组织损伤是否导致纤维化的重要启动因素，但肝脏组织损伤后是否最终导致肝纤维化的发生则与炎症反应与肝组织修复之间的调节功能障碍有关[19-22]。肝脏组织损伤后，肝脏修复过程与炎症反应几乎同时启动，此外肝脏还具有再生的能力。肝脏再生和修复过程中，需精密调控肝脏内细胞的存活和死亡、细胞生长和和分化、ECM 的重构和降解、细胞因子的产生和氧化应激等过程的平衡[1,23,24]。一旦当参与其中的信号通路、细胞因子和细胞发生功能异常，就有可能导致肝脏组织修复失调，那么当肝脏组织发生过度修复反应时就会导致肝纤维化的产生。因此，导致肝纤维化形成的主要原因是肝脏炎症反应和修复反应之间的相互作用而导致的肝组织微环境改变[22]。肝纤维化微环境的改变主要包括：①促纤维化细胞因子的表达增加，抑制组织纤维化的细胞因子表达减少；②基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶组织抑制剂系统失衡；③氧化系统/抗氧化系统失调，产生氧化应激反应；④趋化因子及其受体表达增加等[23]。因此，肝纤维化微环境的改变将会进一步加剧肝细胞损伤，朝着

策略,五味子,五味子乙素

图 0- 2 肝纤维化的治疗策略（Gut. 2015 May;64(5):830-41）综上所述，虽然我们对肝纤维化的发病机制及治疗也有了一定的进展，但是目抗肝纤维化药物疗效并不理想，且副作用较大。因此，继续深入研究并开发安全效及副作用小的抗肝纤维化药物仍是目前肝脏疾病研究的重点内容。（三）五味子乙素的药理作用研究进展五味子（Schisandra chinensis）是木兰科植物五味子的成熟干燥果实，《新修本》中记载五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味，，故有五味子之名。五味子在中已有两千多年的药用历史，具有敛肺滋肾、生津止汗、涩精止泻、宁心安神之功。现代研究发现，五味子提取物具有保肝利胆、补肾安神、抗肿瘤及保护心血管药理作用[42,43]。五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是五味子木脂素类成分中最要的活性成分之一，结构如图 0-3B，分子式为 C23H28O6，分子量为 400.46。大量研究报道已证实五味子乙素具有广泛的药理学活性作用，如抗氧化、抗炎、抗肿和保肝等[44-46]。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】