枸杞多糖通过SIRT1调节肝细胞脂质代谢的机制研究

发布时间：2020-06-09 13:00

【摘要】：研究背景肝脏不仅是内源性和外源性脂质代谢途径的交汇点,而且是维持体内脂质合成与分解代谢平衡的重要靶器官。高能量饮食摄取不仅诱发全身性能量代谢途径失衡,而且引发肝脏脂质代谢紊乱,最终导致代谢综合症如肥胖、2型糖尿病、高脂血症及非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发生。近年来,NAFLD呈全球蔓延趋势,在我国的发病率也日益上升,并逐渐呈现低年龄态势。临床NAFLD的病理特征是肝细胞内脂肪异位沉积,若大量脂肪弥漫性浸润,则会演变为非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH),甚至是肝纤维化或肝硬化。NAFLD的致病基础是肝细胞内甘油三酯的从头合成途径(de novo lipogenesis,DNL)逐渐增强,而脂质分解及转运途径相继减弱,造成甘油三酯大量堆积,从而严重破坏肝细胞脂代谢平衡。由此可见,肝脏脂质代谢失衡是形成脂肪肝的基础。现阶段,临床针对NAFLD的治疗仍主要采取适度理疗、服用降血脂药物及肝脏保护剂等,但是药效甚微,无法达到根本治疗NAFLD的目的。因此,加快研发针对性治疗NAFLD的药物势在必行。沉默调节因子1(sirtuin 1,SIRT1)是一种依赖于NAD+的去乙酰化酶,研究发现它不仅参与了细胞的能量代谢调节,而且能够改善骨骼肌胰岛素敏感性、肝细胞内的炎症反应及氧化应激损伤。最近报道,SIRT1在NAFLD中发挥着重要调节作用。Sirt1+/-小鼠给予正常饮食后,肝脏中甘油三酯合成增加,同时伴随脂肪异位沉积。而肝脏SIRT1过表达可以明显抑制高脂诱导的脂肪肝症状。研究发现SIRT1可以调节类固醇类元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding protein 1c,SREBP-1c)和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)等与脂质合成相关的核转录因子。在肝细胞中SIRT1对SREBP-1c去乙酰化,可以显著抑制SREBP-1c下游脂质代谢相关限速酶和自身的转录活性,从而极大削弱了甘油三酯DNL途径。在Sirt1-/-小鼠模型中,发现脂肪细胞急剧减少,并伴随PPARγ活性几乎完全消失。后续研究者发现,SIRT1还可以去乙酰化PPARγ共辅因子,阻碍脂肪细胞分化及成熟。除此之外,SIRT1还可以通过激酶如肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)去乙酰化作用发挥代谢通路调控效应。研究证实经SIRT1去乙酰化的LKB1更容易磷酸化AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)。AMPK昼夜节律的变化依赖于下丘脑的调节,因此AMPK是一种关键的细胞能量感受器,其生物活性变化受制于AMP/ATP比值调节。已发现,LKB1和Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶激酶(calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase,Ca MKK)都可以直接磷酸化AMPK。活化的AMPK可以直接调节脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)和激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase,HSL)的表达,促进脂肪动员。AMPK可以磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-Co A carboxylase,ACC),导致中间产物丙二酰单酰辅酶A(malonyl-Co A)的减少,解除脂肪酸分解酶---肉碱棕榈酰转移酶-1α(carnitine palmitoyltransferase-1α,CPT-1α)的抑制,加速脂肪酸氧化与利用。上述报导表明,SIRT1/AMPK通路在调节肝细胞脂质代谢稳态方面发挥着多样且重要的作用,为NAFLD药物筛选和机制讨论提供了新的思路。现代研究证实,中药枸杞生物药理学作用都与其成熟果实中重要化学成分枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,LBP)直接相关。而LBP由于出色的抗氧化效应在抗衰老、抗肿瘤、细胞调节、神经调节、免疫调节等多方面有着显著的功能。本课题前期已经报道,LBP通过干预高脂诱导NAFLD小鼠模型,明显减少了全身性及肝脏组织中甘油三酯含量。然而,LBP调节肝脂质代谢的具体机制仍不清楚。正如上文所述,肝脏作为脂肪合成、储存的主要器官,脂肪酸的合成与氧化平衡是脂代谢最重要的机制,LBP如何调节关键的能量代谢调节分子SIRT1的基因表达与活性,如何通过SIRT1/AMPK这个重要的信号通路调节肝细胞内脂肪代谢?对于上述问题的回答,将为深入理解枸杞多糖药用价值提供更加深刻、精细的理论依据。研究目的证实LBP可能通过SIRT1介导调节肝细胞内脂质代谢;证实LBP可以直接调节肝细胞内SIRT1表达及活性;证实LBP可以通过活化SIRT1/AMPK通路改善高脂诱导的NAFLD。研究方法1.采用不同浓度梯度LBP体外孵育Hep G2细胞24 h,运用NAD+/NADH试剂盒检测LBP是否增加胞内NAD+水平及NAD+/NADH比值;运用WB检测SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表达。采用不同浓度LBP与人SIRT1重组蛋白和NAD+底物共孵育1 h,运用SIRT1活性试剂盒检测LBP是否激活SIRT1去乙酰化活性。采用LBP不同时间孵育Hep G2细胞,运用WB检测SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表达。2.采用LBP孵育Hep G2细胞24 h,运用IP检测LBP是否增加LKB1去乙酰化表达;运用WB检测phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表达。采用LBP干预PA处理的Hep G2细胞,运用WB检测SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表达;运用油红O染色及定量分析肝细胞内脂滴形成情况。3.采用LBP干预SIRT1 si RNA转染的Hep G2细胞,运用IP检测LBP对LKB1去乙酰化效应;运用WB检测SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表达。采用SIRT1 si RNA转染PA处理的Hep G2细胞后,LBP干预24 h,运用WB检测SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表达;运用酶比色法检测肝细胞内甘油三酯含量。4.采用不同剂量LBP干预高脂诱导NAFLD模型12周,检测饮食、饮水、体重、肝湿重及血清甘油三酯变化,运用HE和油红O染色观察肝组织的脂滴堆积情况;运用酶比色法检测肝组织内甘油三酯含量;运用ELISA试剂盒检测血清及肝组织内的malonyl-Co A含量;运用q PCR检测ACC1,FAS,ELOVL6,DGAT及CPT-1α表达;运用WB检测SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表达。5.采用p CDH-SIRT1过表达质粒转染正常或PA处理的Hep G2细胞24 h,运用WB检测SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表达。采用SIRT1过表达慢病毒尾静脉注射NAFLD小鼠模型,运用HE和油红O染色观察肝组织的脂滴堆积情况;运用酶比色法检测肝组织内甘油三酯含量;运用ELISA试剂盒检测血清及肝组织内的malonyl-Co A含量;运用q PCR检测ACC1,FAS,ELOVL6,DGAT及CPT-1α表达;运用WB检测SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表达。6.采用SIRT1 sh RNA慢病毒尾静脉注射LBP干预NAFLD模型小鼠,运用HE和油红O染色观察肝组织的脂滴堆积情况;运用酶比色法检测肝组织内甘油三酯含量;运用ELISA试剂盒检测血清及肝组织内的malonyl-Co A含量;运用q PCR检测ACC1,FAS,ELOVL6,DGAT及CPT-1α表达;运用WB检测SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表达。研究结果1.LBP以浓度或时间依赖性增加SIRT1表达0-900μg/m L LBP分别孵育Hep G2细胞24 h,LBP以浓度依赖性增加SIRT1蛋白表达;600μg/m L LBP以0 h,6 h,12 h,24 h,48 h分别孵育Hep G2细胞,LBP以时间依赖性增加SIRT1蛋白表达。2.LBP上调NAD+/NADH比值及增加SIRT1去乙酰化活性300和600μg/m L LBP分别孵育Hep G2细胞24 h,发现LBP以浓度依赖性增加了NAD+水平及NAD+/NADH比值;100-600μg/m L LBP分别与人重组蛋白和NAD+底物共孵育1 h,发现LBP以浓度依赖性上调了SIRT1去乙酰化活性。3.LBP通过SIRT1增加了LKB1去乙酰化表达和AMPK磷酸化表达600μg/m L LBP孵育Hep G2细胞24 h,通过IP实验显示LBP增加LKB1的去乙酰化表达。0-900μg/m L LBP分别孵育Hep G2细胞24 h,WB显示LBP明显呈浓度依赖性增加phospho-AMPK和phospho-ACC的表达。250μM PA处理Hep G2细胞12 h后,600μg/m L LBP干预0 h,6 h,12 h,24 h,48 h,WB结果显示,LBP呈时间依赖性增加phospho-AMPK和phospho-ACC的表达。4.LBP调节肝细胞脂质合成与分解代谢0-900μg/m L LBP分别孵育Hep G2细胞24 h,发现LBP呈浓度依赖性减少了肝细胞内的脂滴堆积,同时增加ATGL表达和减少FAS表达。250μM PA处理Hep G2细胞12 h后,0-900μg/m L LBP干预24 h,WB结果显示LBP依旧可以增加ATGL表达、减少FAS表达。5.LBP可在体内通过SIRT1/AMPK通路缓解NAFLD100和200 mg/kg LBP干预高脂喂养小鼠12周,LBP明显降低小鼠体重及肝湿重;肝脏形态及染色显示,LBP明显减少了肝脏内脂滴形成;血清及肝组织甘油三酯测定提示,LBP可以改善高脂诱导的血脂异常;肝组织WB显示,LBP增加了SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC和ATGL表达、减少FAS表达;ELISA实验显示,LBP可以明显降低ACC作用产物malonyl-Co A含量累积;q PCR结果显示,LBP明显抑制脂质合成酶表达,而促进脂肪酸氧化酶的表达。此外,LBP还可以改善小鼠血脂异常和耐量实验。6.SIRT1过表达减少肝细胞内的甘油三酯合成通过体外SIRT1质粒瞬时转染及体内尾静脉注射SIRT1慢病毒,我们发现SIRT1过表达可以明显改善肝细胞脂质代谢,从而缓解高脂诱导的NAFLD。7.SIRT1 sh RNA拮抗LBP调节脂质代谢的效应SIRT1 si RNA转染PA处理的Hep G2细胞并给予LBP干预24 h,WB和甘油三酯测定结果显示,SIRT1 si RNA可以扭转LBP的降脂效应。LBP干预的高脂喂养小鼠模型尾静脉注射SIRT1 sh RNA慢病毒,继续喂养7天。通过HE、油红O染色及甘油三酯含量测定等实验,SIRT1 sh RNA明显抑制了LBP的减脂效应;WB和q PCR结果显示,SIRT1 sh RNA抑制了SIRT1/AMPK信号通路的开放,诱导malonyl-Co A含量增加,加重动物血脂紊乱。研究结论1.证实LBP可以增加肝细胞内SIRT1蛋白表达与活性。2.证实LBP可以活化肝细胞内SIRT1/AMPK信号通路。3.证实LBP可以通过SIRT1/AMPK通路调节肝细胞内的脂质合成与分解。
【图文】：

三种SIRT1siRNA的沉默效应

pCDH-SIRT1双酶切核酸电泳图
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
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本文编号：2704724