独活天然成分CBN抑制NTHi诱导的AECOPD小鼠炎症的机制研究

发布时间：2020-06-10 04:34

【摘要】：目的:为研发安全、有效和机制明确的可替代ICS的新型抗AECOPD气道炎症的天然药物,并提供药理毒理学的理论依据和数据支持,本论文拟通过构建LPS诱导的人巨噬细胞THP-1炎症模型,体外观察独活中天然活性成分二氢欧山芹醇当归酸酯(CBN)对炎症因子的调节作用;结合PCR Array、基因沉默与过表达、分子对接技术筛选及验证CBN对炎症相关基因通路的影响;然后通过CBN对小鼠灌胃给药急性毒性实验观察其毒性反应;进一步通过建立NTHi诱导的小鼠AECOPD模型,观察CBN的抗AECOPD作用;结合代谢组学等手段探讨CBN抗AECOPD的机制。方法:1、CBN对LPS诱导的THP-1细胞炎症模型的作用(1)LPS刺激THP-1细胞,体外模拟细菌感染状态,建立LPS诱导的THP-1细胞炎症模型,利用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbant assay,ELISA)分别测定低剂量(30μg/mL)、中剂量(50μg/mL)和高剂量(100μg/mL)CBN对炎症细胞模型中细胞因子TNF-α、IL-1β及单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)分泌的影响。(2)以PCR Array筛选和分析受CBN影响的差异表达炎症相关基因;结合KEGG数据库筛选差异表达基因富集程度最高的基因通路;qP CR检测筛选出的基因通路中关键基因表达情况,验证CBN对其调节作用。2、CBN通过NOD1抑制LPS诱导的THP-1细胞炎症状态分别将NOD1的siRNA或过表达质粒pc DNA3.1转染入THP-1细胞,qP CR检测NOD1基因表达水平以判定转染效率;采用qP CR和Western blot检测细胞炎症模型中CBN作用后的NOD1、RIP2和NF-κB P65 mRNA和蛋白表达水平;ELISA检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β和MCP-1表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡情况。3、CBN对AECOPD模型小鼠的作用研究(1)CBN小鼠灌胃给药急性毒性试验灌胃给药2次。单次给药剂量为2500mg/kg,总给药剂量为5000 mg/kg。给药后1小时和4小时内进行观察,此后14天每天进行一次观察。第0、3、7和14天称量体重,观察期末对所有动物进行大体解剖。(2)CBN对AECOPD小鼠模型肺功能的影响烟雾刺激16周建立小鼠COPD模型,烟雾刺激第15周末时气管内注射NTHi 108 CFU/mL,建立小鼠AECOPD模型。随后灌胃给予CBN(50、100和200 mg/kg)7天,小动物肺功能仪检测小鼠肺功能:第0.1秒呼出的气体(Forced Expiration Volume in 100ms,FEV0.1)、肺功能残气量(Functuional Residual Capacity,FRC)和气道阻力(Airway Resistance,RI);(3)CBN抗AECOPD作用的机制流式细胞术检测CBN作用前后BALF中性粒细胞数量变化;HE染色检测肺组织炎症浸润程度;ELISA检测BALF中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的表达量。采用qP CR、Western blot和免疫组织化学染色检测肺组织中NOD1、RIP2和NF-κB P65基因和蛋白表达水平的变化,同时利用分子对接手段,模拟CBN与受体蛋白的结合模式与亲合力。4、代谢组学技术研究CBN对AECOPD小鼠血清代谢物的影响CBN干预AECOPD小鼠的血清样本非靶标代谢组学研究利用药物代谢组学研究手段,采用UPLC-QTOF-MS技术结合与多元统计分析,对正常组、AECOPD模型组小鼠以及CBN高剂量组小鼠血清中小分子内源性代谢物及相关代谢途径进行研究,进一步从整体水平阐明CBN的可能作用机制。结果:1、CBN对LPS诱导的THP-1细胞炎症模型的作用及差异表达基因的筛选(1)3个剂量组的CBN处理LPS诱导的THP-1细胞后,TNF-α,IL-1β和MCP-1等促炎性细胞因子的分泌显著减少(p0.01),提示CBN在体外具较好的抗炎作用。(2)PCR Array分析发现,经CBN作用后,LPS诱导的THP-1细胞中被调节的差异表达基因46个,且主要集中在NOD1/NF-κB通路上,提示CBN可能是通过影响该通路进而抑制炎性细胞因子的产生,发挥抗炎作用。2、CBN通过NOD1抑制LPS诱导的THP-1细胞炎症状态建立了NOD1基因沉默和过表达的THP-1细胞模型;当NOD1基因沉默后,50μg/mL CBN对RIP2和NF-κB P65表达水平的调节作用降低或消失(p0.1),对细胞上清液中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和MCP-1水平的调节作用也减弱或消失(p0.1),CBN对LPS引起的THP-1细胞凋亡抑制作用减弱(p0.05);NOD1基因过表达后,CBN可显著降低LPS引起的THP-1细胞中RIP2和NF-κB P65表达水平(p0.01),同时降低了细胞上清液中炎性细胞因子的分泌水平(p0.01),LPS诱导的THP-1细胞凋亡状况也显著被抑制(p0.01),证实CBN通过NOD1信号途径发挥其抗炎作用。3、CBN对AECOPD模型小鼠的作用研究(1)CBN小鼠灌胃给药急性毒性试验:在本试验条件下,CBN以2500 mg/kg的剂量对小鼠1日内灌胃给药2次,观察14天,未见对动物产生明显的毒性反应,其半数致死剂量大于5000 mg/kg。(2)CBN对AECOPD小鼠模型肺功能的影响:AECOPD小鼠FEV0.1较正常组显著降低,FRC及RI均较正常组显著升高,经CBN作用后均下降;(3)CBN抗AECOPD作用的机制:肺组织HE染色表明CBN可显著抑制NTHi感染引起的肺组织炎症状况;小鼠BALF中中性粒细胞数量显著降低(p0.01),BALF中TNF-α,IL-1β和MCP-1的分泌水平也显著降低(p0.01);肺组织中NOD1、RIP2和NF-κB P65基因和蛋白表达水平经CBN作用后显著降低(p0.01),提示CBN能够抑制NTHi诱导的小鼠AECOPD,其作用可能是通过抑制NOD1-RIP2-NF-κB通路的活化,进而抑制炎性细胞因子产生,以及中性粒细胞的浸润所介导的。另外,分子对接结果表明CBN能够较好的嵌入RIP2受体的活性口袋,有较好的空间及电性互补,与ASP-164氨基酸残基形成1个氢键。4、代谢组学技术研究CBN对AECOPD小鼠血清代谢物的影响对CBN干预AECOPD小鼠的血清样本非靶标代谢组学研究:与正常对照组小鼠比较,AECOPD模型小鼠血清中一些内源性代谢物含量发生了明显改变,CBN干预后可显著回调α-酮戊二酸、柠檬酸、丙氨酸、5-HETE、谷氨酸、谷氨酰胺、白三烯A4、12,13-EpOME、棕榈酸、16(R)-HETE、视黄酯、19(S)-HETE、油酸、二十二碳六烯酸、卵磷脂、花生四烯酸、亚油酸、20羟基-白三烯B4、维生素A等24种内源性代谢物水平,提示CBN可能通过调控花生四烯酸代谢、谷氨酰胺代谢和D-谷氨酸代谢、亚油酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、视黄醇代谢以及三羧酸循环等代谢通路而发挥抗小鼠的AECOPD作用。结论:1、CBN能够抑制AECOPD气道炎症,有效缓解小鼠肺功能,对AECOPD模型小鼠具有一定的治疗作用;2、CBN对AECOPD模型小鼠的治疗作用也与NOD1-RIP2-NF-κB通路活化及炎性细胞因子的表达相关;3、CBN对AECOPD的治疗作用可能与其对炎症因子的调节作用以及对花生四烯酸、维生素A等24种内源性代谢物水平的调节作用相关。花生四烯酸代谢、谷氨酰胺代谢和D-谷氨酸代谢、亚油酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、视黄醇代谢以及三羧酸循环可能是其发挥抗AECOPD作用的代谢途径。创新点:1、本研究观察了中药独活中香豆素类天然产物CBN的急性毒性反应,为评价该天然活性成分的毒副作用提供了理论数据。2、本研究利用中药成分多靶点的特性,对CBN的体内、外抗AECOPD作用进行了筛选。明确了CBN能对NTHi诱导AECOPD小鼠气道炎症起抑制作用。3、探讨了CBN的抗AECOPD气道炎症作用机制。揭示了NOD1/NF-κB通路以及花生四烯酸代谢、谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、亚油酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、视黄醇代谢以及三羧酸循环可能是CBN发挥抗炎作用的关键信号通路和代谢途径。综上,本论文开展的天然成分CBN对NTHi诱导AECOPD小鼠气道炎症的抑制作用与机制研究,丰富了CBN的药理毒理研究,可为从传统中草药及其天然产物中寻找开发新型安全有效、机制明确的可替代ICS的抗AECOPD炎症药物提供重要的理论和实验依据,也其他炎性疾病的治疗和作用机制研究提供思路和启示。
【图文】：

色谱,当归酸,二氢,独活

氢呋喃香豆素类成分[153]。1961 年，首次从氢欧山芹醇，对 CBN 的研究起步较晚，有N 主要存在独活中。独活(Angelicae Pubesce 一部，为伞形科植物重齿毛当归 Shan et Yuan 的干燥根，春初苗刚发芽或秋末烘至半干，堆置 2～3 天，发软后再烘至全效。临床多用于风寒湿痹，，腰膝疼痛，少阴效成分之一即为二氢欧山芹醇当归酸酯。-水(1.5∶2.5∶2∶1)为 HSCCC 溶剂系统，在色谱(HSCCC)法分离制备高质量分数的 Cg 裂叶独活浸膏中，得到 6.4 mg CBN，质量裂叶独活中 CBN 等香豆素类成分的快速分离

存活率,炎性细胞因子,低剂量,表达性

图 2.1 CBN 对 THP-1 细胞存活率的影响Fig.2.1 Effect of CBN on the viability of THP -1.001,LPS vs Ctrl; * p< 0.05vs LPS group; ** p< 0.01vs LPS groupresentative of three independent experiments with similar results. DatD.N 对 LPS 诱导 THP-1 细胞模型中炎性细胞因子表达的影确 CBN 是否能够抑制炎性细胞因子的表达，发挥抗炎测正常组、LPS 组、低剂量组、中剂量组及高剂量组细胞因子 TNF-α、IL-1β、MCP-1 的表达量。结果如图 2.2 所h 后，LPS 模型组中 TNF-α、IL-1β、及 MCP-1 的表达水高(p<0.001)。CBN 低、中、高剂量组炎性细胞因子表达性降低，其中低剂量组降低幅度较小(p<0.01, p<0.05)，中
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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