基于分子对接的射干抗气道炎症机制研究

发布时间：2020-06-10 10:28

【摘要】：目的:本专题借助国家自然科学基金和国家“十二五”重大新药创制项目资助,拟以射干药材为研究对象,通过古典医籍考证及现代文献资料,初步确定药材功能主治及临床适用病症;利用临床验证试验明确适用病症筛选的准确性;采用动物实验,探索药物对筛选病症的初步作用模式;依靠分子对接技术,预测药材活性组分与体内受体蛋白靶点之间的结合模式和亲和力,模拟药物可能的作用机制;采取模型动物实验,选择模拟筛选的作用靶点为测定指标,从蛋白表达、体内生物标记物变化方面对所预测的机制进行试验验证,确定药物治疗疾病多成分、多途径、多靶点作用机制,探讨建立中医药转化医学研究的新方法及新技术可行性。材料与方法:1.通过查阅春秋战国至明清时期的古典医籍,结合射干古代方剂配伍应用考察分析,对射干及其组方在不同历史时期功能主治、适用病种及性味归经进行归纳,明确了射干应用的演变过程。利用《普济方》数据库管理系统,对射干跨病种检索,可得含射干复方在治疗所有疾病的分布情况,并与历代本草学和《中华人民共和国药典》记载的功能主治相比较。基于现代文献学研究,对射干现代药理作用进行归纳整理。依据传统中医药理论,对射干最佳治疗适应症型进行分析。2.在前期文献研究确立射干药材临床适应证型基础上,通过设计基于临床适应病症-急性支气管炎及感染后咳嗽的临床验证试验方案,在经过辽宁省药品监督管理局审批及医院伦理委员会讨论通过后,采用随机、双盲、对照试验的方法对射干药材临床应用最佳病症进行筛选研究。临床评价试验选择感染后咳嗽(治疗组和阳性药对照组)、急性气管-支气管炎病症(治疗组和阳性药对照组),以肺宁片(返魂草制剂)作为阳性对照药,按1:1的比例安排病例数。其中临床评价试验例数为:感染后咳嗽组为每组40例,急性气管-支气管炎组为每组60例,共200例。急性气管-支气管炎和感染后咳嗽各两组病例在性别、年龄、病程及病情轻重上经统计学处理,差异无显著意义(P0.05),具有可比性。治疗组给予射干制剂,1.2g/次(3次/日);对照组给予肺宁片,5片/次(3次/日);疗程为10天。所有病例均符合诊断标准,不符合排除标准。分别对治疗前后患者日间咳嗽评分、夜间咳嗽评分、咳痰情况、痰量评分、白细胞计数评分、中性粒细胞计数评分及淋巴细胞百分比评分进行测定。采用SPSS统计软件对结果进行配对T检验。3.根据两个证型临床验证试验结果,考虑感染后咳嗽在患病人群中更为常见,患者量较大,且在临床上没有较为有效的治疗手段,因此选择其作为射干药材作用机制研究的方向。实验选取40只SPF级豚鼠适应性饲养一周后,随机分为4组,分别为空白组、模型组、射干提取物组(600 mg/kg/天),中药阳性(肺宁片512 mg/kg/天)对照组,每组10只。采用烟熏、RSV滴鼻、枸橼酸雾化诱咳,建立豚鼠合胞病毒感染后咳嗽模型。造模后,除模型组外,其它各给药组在第8天时开始给药,连续给药7天,空白组给予等体积生理盐水。末次给药后45 min,将实验豚鼠用2%戊巴比妥(25 mg/kg)麻醉后仰卧固定于操作台,采集血液及肺组织等实验研究用样本。观察模型动物给药前后白细胞总数及分类计数变化;HE染色观察肺组织形态学变化;观察治疗前后咳嗽次数的变化;采用HPLC-MS测定肺组织中花生四烯酸含量的变化。4.从花生四烯酸代谢网络的多靶标药物研究思路出发,利用分子对接的技术,借助虚拟筛选手段,对射干抗炎可能的作用靶点进行预测(基于分子对接技术,)。通过国内外文献检索及TCMSP数据库,归纳了已报道的分子结构明确的50个射干异黄酮类化合物;利用PDB数据库下载获得了与花生四烯酸代谢途径相关PLA2、COX-1、COX-2、5-LOX、LTA4H、CYP450蛋白结构。蛋白质结构处理和配体结构构建选用Sybyl6.91软件包,分子对接研究由Auto Dock 4.02软件完成,并由Discovery Studio Visuliazer 4.0软件包观察结果。从晶体结构中提取共结晶配体作为对照分子,以相对分值(R=化合物分值/对照分子分值)来比较化合物与靶点的作用强度。将射干中50个异黄酮类化学成分与花生四烯酸3条通路上的7个主要蛋白靶点PLA2、COX-1、COX-2、5-LOX、LTA4H、CYP450(2vn0、5a5i)分别进行分子对接,根据评分结果模拟射干药材抗炎作用机制。5.根据分子对接相对应的分值(R)结果,模拟出射干药材可能通过抑制COX-2、5-LOX和CYP450等信号通路发挥多途径、多靶点抗炎作用。验证实验采用Western-blot法检测模型动物豚鼠给药后肺组织中COX-2和5-LOX蛋白表达水平;采用蛋白试剂盒提取肺组织中蛋白,并采用BCA法检测蛋白浓度。根据待测靶标蛋白分子量确定分离胶浓度。采用HPLC-MS-MS法;格列本脲(DHDT系列)和PGB1(PGs和HETE系列)为内标物;乙酸乙酯提取,合并上清液,氮气吹干,100μL甲醇溶解,13500 r/min离心5 min后,吸取上清液作为供试品溶液;10 mmol/L醋酸铵水溶液(A):甲醇(B)0-15 min,52-68%B为流动相,流量0.3 ml/min,柱温40℃,进样量5μL检测花生四烯酸COX通路代谢产物TXB2、PGD2、PGE2;水(A)—乙腈(B)48:52为流动相,流量0.3 ml/min,柱温40℃,进样量5μL检测CYP通路代谢产物8,9-DHET、11,12-DHET、14,15-DHET;水(A)—乙腈(B)38:62,柱温30℃,流量0.3 ml/min,进样量5μL检测LOX通路代谢产物5HETE、15HETE的变化,明确射干药材抗炎作用机制。结果:1.射干功能主治本草考证研究结果表明,射干始载于《神农本草经》,从古至今为治疗咽喉肿痛及痰多咳喘的常用药,具有清热解毒、宣肺化痰功能,用于治疗咳嗽、发热、口渴、咯痰等病症。基于《普济方》数据库古方配伍应用考证结果表明,含射干复方所治疾病以喉痹咽痛、咳嗽、咳喘、咽干、痰热壅盛诸病与2015年版《药典》一部所记功能主治完全吻合。所治脚气、调经等作用,《药典》一部则未收录。现代文献学研究表明,射干具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等药理作用。结合传统中医药理论研究结果,考虑急性气管-支气管炎(风邪犯肺证)及感染后咳嗽(余热未清证)在炎性表现方面一急一慢,发病方面风热犯肺表现在前期,后期入里化热、余热未清,颇具代表性,故选择此二证为射干临床应用试验病征。2.基于射干药材最佳临床适应病种的急性气管-支气管炎和感染后咳嗽临床评价结果表明:从日间咳嗽评分、夜间咳嗽评分、咳痰情况、痰量评分、白细胞计数评分、中性粒细胞计数评分及淋巴细胞百分比评分方面,射干制剂均有良好效果。虽然与对照药肺宁片比无显著性差异,但射干制剂治疗组相关指标优于肺宁片组。提示基于传统文献与现代文献研究的临床最佳病种选择这一中医药转化医学研究思路具有一定的可行性。3.在射干制剂临床应用最佳病种筛选基础上,选择病毒感染后咳嗽动物模型作为药物初步作用模式研究的动物模型。体内动物实验结果表明,复制RSV感染豚鼠咳嗽模型,通过检测豚鼠肺组织匀浆能引起Hep-2细胞病变,证实合胞病毒感染成功;肺组织病理学检查支持气道炎症改变明显,而肺实质炎症无明显改变;模型动物组血清中,白细胞总数、淋巴细胞计数、单核计数、中性粒细胞计数及嗜酸粒细胞计数与空白组相比,均无显著差异;动物模型组5 min内咳嗽次数显著高于空白组。干预药物射干制剂组能明显抑制模型动物5 min内咳嗽次数,减轻肺组织中支气管和周围炎症,降低肺组织中花生四烯酸含量。据此推测,射干药材通过干预花生四烯酸炎症代谢网络达到抗炎、止咳作用。4.模型动物药效学评价及作用机制实验结果表明射干药材的抗炎作用与花生四烯酸代谢网络相关。因此,通过分子对接技术,利用相关数据库及分子对接软件,分别模拟了射干药材所含50个黄酮类化合物的分子量、氢键给体、氢键受体及脂水分配系数,结果表明射干黄酮类化合物符合“Lipinski”类药性规则,表明射干黄酮具有良好的类药性。射干黄酮成分与花生四烯酸代谢通路七个抗炎靶点的打分值依次为:COX-2㧐5-LOX㧐COX-1㧐CYP450(5a5i)㧐PLA2㧐LTA4H㧐CYP450(2vn0),其中射干黄酮成分与COX-2对接结果最好,50个化合物的结合常数均大于对照分子。与5-LOX和COX-1对接结果较好,R值均大于0.8。与CYP450(5a5i)亚型分子对接的相对分值也较好,有43个化合物的分值≥0.8,。表明射干药材所含黄酮类成分可能通过多成分、多途径、多靶点发挥抗炎、止咳作用,其作用途径可能与COX、5-LOX及CYP450有关。5.基于分子对接模拟实验结果,用Western-blot检测模型动物豚鼠肺组织中COX-2和5-LOX蛋白表达水平。WB实验结果表明,与正常对照组比较,模型组COX-2、5-LOX蛋白表达水平显著升高(P0.05),说明所建立合胞病毒感染豚鼠咳嗽模型可激活花生四烯酸代谢COX-2和5-LOX信号通路,使得致炎性花生四烯酸代谢产物大量生成。射干提取物组COX-2蛋白表达水平显著降低(P0.05),而5-LOX蛋白表达无显著降低(P0.05),提示射干药材可能通过抑制花生四烯酸COX-2代谢途径,减少致炎性代谢产物的生成。花生四烯酸代谢产物含量测定结果表明:在COX代谢途径研究中,应用液相-质谱联用法测定了其信号通路代谢产物PGD2、TXB2、11HETE和PGE2的含量。与正常对照组比较,模型组肺组织中PGD2、TXB2、11HETE含量显著升高(P0.05),给予射干提取物后各代谢产物含量均下降(P0.05)。结合蛋白印迹结果,推测射干提取物可能是通过抑制COX2表达,降低代谢产物PGD2、TXB2、11HETE的释放,减缓炎症的进程。在LOX代谢途径研究中,应用液相-质谱联用法测定了其信号通路代谢产物5HETE和15HETE的含量。实验结果表明,与正常对照组比较,模型组肺组织中5HETE和15HETE含量显著升高(P0.05),说明所建立豚鼠感染后咳嗽模型可激活AA代谢LOX途径,使得致炎性AA代谢产物5HETE和15HETE大量生成。给予射干提取物后各代谢产物含量有降低趋势,但是没有统计学意义。结合蛋白印迹结果,推测射干提取物对LOX及其代谢产物的抑制作用不明显。在CYP450途径中,测定了代谢产物8,9-DHET、11,12-DHET、14,15-DHET和16HETE的含量。与正常对照组比较,模型组肺组织中16HETE含量显著升高(P0.05),给予射干提取物后16HETE含量有降低趋势,但是没有统计学意义。但是给药组的11,12-DHET、14,15-DHET含量显著降低(P0.05)。推测射干提取物能影响CYP表氧化酶途径生成11,12-DHET、14,15-DHET。结论:1.射干从古至今为治疗咽喉肿痛及痰多咳喘的常用药,通过古典医籍考证及现代药理研究,具有清热解毒、宣肺化痰之功效,推测射干适合治疗风热病邪引起的病症,主要包括余热未清证和风热犯肺证。2.射干制剂在治疗感染后咳嗽及急性气管-支气管炎具有很好临床疗效,表明基于古典医籍和现代文献确定药物治疗病种这一中医药转化医学思路具有一定的可行性。3.采用RSV感染豚鼠可以成功复制病毒感染咳嗽模型;中药射干提取物能明显抑制模型动物咳嗽次数,减轻肺组织炎症,降低肺组织中花生四烯酸含量,表明射干药材通过干预花生四烯酸炎症通路发挥抗炎、止咳作用。4.基于射干药材活性组分的分子对接模拟实验结果表明:射干黄酮类成分干预花生四烯酸炎症通路达到抗炎作用途径可能与COX和5-LOX靶点相关;射干药材与花生四烯酸代谢通路七个抗炎靶点的对接结合自由能依次为:COX-2㧐5-LOX㧐COX-1㧐CYP450(5a5i)㧐PLA2㧐LTA4H㧐CYP450(2vn0)。5.射干活性组分分子对接验证实验结果表明:射干药材主要通过干预花生四烯酸COX-2、CYP450信号通路达到抗炎、止咳作用。6.通过本专题研究,基于分子对接技术探讨中药作用机制进而开展转化医学研究具有一定的可行性,其能够较早的提示或确定中药多成分、多靶点、多途径发挥疗效的作用机制及靶点。但是中药成分复杂,多成分协同作用所产生的增效减毒或减效增毒作用可能影响其模拟的准确性,引起实验偏差,所以在研究中应该适当增加相应考察指标。
【图文】：

花生四烯酸,图谱

2.7.5 射干提取物对实验动物肺组织中花生四烯酸（AA）的影响取豚鼠肺组织样品约 0.1g，生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重，加 10 倍量 PBS，匀浆，离心（6500 r/min，50s）。取上清液 100μL，加入内标 Ad8 溶液 5 μL，涡旋混合均匀，加乙酸乙酯 1mL，离心（14000 r，10 min），吸出有机相，水相再提取一次，合并乙酸乙酯溶液，氮气吹干，残留物用 100 μL 甲醇溶解，作为 AA供试品溶液。测定条件：流动相：水（A）—乙腈（B）15:85；监测离子为 AA，内标为AA-d8，色谱柱：Poroshell120，EC-C18(3.0×100 mm，2.7 μm，Agilent)；流动相：10 mmol/L 醋酸铵水溶液（A）：甲醇（B）0-15 min，52-68%B；流量 0.3 ml/min；柱温：40℃；进样量：5 μL。质谱条件：ESI 离子源；Gas Flow 8 L/ml，Gas Temp 350 ℃，Nebulizer 40 psi，Capillary 4000 V；负离子方式检测，扫描方式为多反应监测（MRM）。

均浆,病毒学,射干,分子对接

基于分子对接的射干抗气道炎症机制研究析及 LSD 检验。实验结果3 结果3.1 RSV 感染后病毒学检测结果除空白组外，各组的肺组织均浆液在 Hep-2 细胞上培养至第 2 天细胞开始逐渐肿胀、变圆和聚集，，细胞间隙增大，第 4 天形成多核巨细胞或称融合细胞。提示 RSV 病毒感染成功。见图 3-2。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】