盐酸小檗碱对非酒精性脂肪性肝病大鼠免疫屏障影响的研究

发布时间：2020-06-10 10:39

【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)的发病机制尚未完全阐明,“肠-肝轴”学说近几年已成为研究肝脏疾病的热点,其中肠黏膜屏障破坏引起了大家的关注,认为菌群失调、肠黏膜通透性增加、细菌移位,由此引起肠源性内毒素血症(Intestinal Endotoxemia,IETM)可能在NAFLD的发病过程中起重要作用。小檗碱是从中药黄连中提取的一种异喹啉类生物碱,具有较强的抗炎和免疫调节作用。研究表明,盐酸小檗碱能减轻慢性应激引起的肠黏膜损伤;能减少严重腹腔感染或脓毒血症时炎症介质的表达,从而改善受损的肠黏膜屏障,降低肠壁通透性,我们推测盐酸小檗碱可能通过改善肠黏膜屏障功能对NAFLD的治疗起到一定的效果。目的:建立NAFLD大鼠模型,研究盐酸小檗碱通过调节肠道免疫屏障对NAFLD大鼠肠黏膜屏障的作用,为盐酸小檗碱治疗NAFLD提供理论依据。方法:健康清洁级雄性SD大鼠33只(200g±10g),随机分为3组:正常对照组(Normal Control Group,N组)、高脂模型组(High Diet Model Group,M组)、盐酸小檗碱组(Berberine Group,B组)。N组给予普通饲料喂养,M组及B组给予高脂饲料喂养,12周后,每组处死1只,HE染色观察肝细胞脂肪沉积程度确定造模成功。B组给予150mg/(kg.d)盐酸小檗碱灌胃,N组与M组给予等量生理盐水,并根据大鼠体重的变化调整用药量,连续灌胃4周后,麻醉状态下腹主动脉取血,采用全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase,AST)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、胆固醇(Total Cholesterol,TC),采用鲎试剂法测定血清内毒素(Endotoxin)水平,留取肝脏组织标本,HE染色观察肝脏病理学变化;应用ELISA法测定血清白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)水平;在距回盲瓣约2 cm处切取小肠数段,每段2cm留取标本。应用RT-PCR检测核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1(Nucleotide-binding Oligomerization Domain1,NOD1)、核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2(Nucleotide-binding Oligomerization Domain 2,NOD2)、NOD样受体蛋白3(NOD-like Receptor Protein 3,NLRP3)的表达水平,应用Western-blot检测NOD1、NOD2、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、Claudin-4的表达水平。结果:1.喂养12周时M组、B组大鼠体重较N组大鼠体重显著升高(P0.05);B组和M组大鼠体重无差异(P0.05)。HE染色结果显示M组、B组大鼠肝细胞内可见脂肪沉积,证明造模成功。2.喂养16周时,即盐酸小檗碱干预4周后,M组大鼠的体重较N组大鼠的的体重显著升高(P0.05);与M组大鼠相比,B组大鼠体重显著下降(P0.05)。3.喂养16周时,M组大鼠的ALT、AST、TC、TG较N组显著增高(P0.05);与M组相比,B组大鼠的ALT、AST、TC、TG显著下降(P0.05)。4.喂养16周时,M组大鼠内毒素、IL-1β、IL-18、TNF-α较N组大鼠显著升高(P0.05);与M组相比,B组内毒素、IL-1β、IL-18、TNF-α显著下降(P0.05)。5.肝脏组织HE染色:N组大鼠肝小叶结构清晰,肝细胞无脂肪变,与N组大鼠相比,M组大鼠肝小叶结构紊乱,肝细胞肿大,以大泡性脂肪变为主,肝细胞内充满大小不等的脂肪空泡,可见细胞核被挤向一边。经盐酸小檗碱治疗后B组大鼠肝细胞肿胀程度减轻,肝细胞脂肪变减轻,脂肪空泡较少,肝细胞排列较整齐。6.回肠组织NOD1、NOD2、NLRP3表达水平:大鼠喂养16周时,RT-PCR及Western Blot结果显示M组NOD1、NOD2、NLRP3 mRNA及蛋白表达较N组均显著升高(P0.05);B组与M组相比NOD1、NOD2、NLRP3 mRNA及蛋白的表达均显著下降(P0.05)。7.Caspase-1蛋白表达:大鼠喂养16周时,Western blot结果显示M组Caspase-1蛋白量较N组显著升高(P0.05);B组与M组相比Caspase-1蛋白量显著下降(P0.05)。8.Claudin-4蛋白表达:大鼠喂养16周时,Western blot结果显示M组Claudin-4蛋白表达较N组显著下降(P0.05);B组与M组相比Claudin-4蛋白表达显著升高(P0.05)。结论:1.高脂饮食喂养能成功建立NAFLD大鼠模型,NAFLD大鼠内毒素表达水平增高。2.盐酸小檗碱可以降低NAFLD大鼠体重,改善肝脏功能,降低血脂,减轻肝脏脂肪变性程度。3.盐酸小檗碱可以降低NAFLD大鼠内毒素水平,降低炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α水平。4.盐酸小檗碱抑制肠道黏膜免疫屏障相关的NOD1、NOD2、NLRP3mRNA及NOD1、NOD2、NLRP3、Caspase-1蛋白表达。5.盐酸小檗碱提高NAFLD大鼠肠黏膜通透性相关的Claudin-4蛋白表达。
【图文】：

HE染色

M 组和 B 组肝脏组织 HE 染色（×200）Fig.1 HE staining of liver tissues(×200) in group N, group M and group B

25PCR 分析大鼠喂养 16 周时各组肠道组织中 N表达RNA expression of NOD1 using RT-PCR analystissue in different groups fed after 16 weeksNote:*P<0.05 versus N,and #P<0.05 versus
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5;R-332

【参考文献】