【摘要】：1.研究背景与目的溃疡性结肠炎(Ulcerative coloitis,UC)是一种慢性炎症性结肠疾病,特征表现为结肠黏膜由直肠起始并延续至结肠近端的大面积溃疡,UC的疾病过程包括潜伏期与发作期,临床常见症状有腹痛、腹泻、脓血便、黏液排出、发热、体重减轻等,病程漫长伴随间歇性发作,严重影响患者生活质量,是诱发结肠癌的关键因素之一。临床常用氨基水杨酸盐如美沙拉嗪等来缓解症状,但因副作用强烈无法长期维持治疗,亟求新的治疗手段。中医理论认为,同一种疾病常因病情发展阶段、个人体质或所处环境不同而呈现出不同的病机与证候,应对其外在表现进行辩证论治后,根据不同的治则治法来对证用药。溃疡性结肠炎属中医诊疗理论中的“泄泻”范畴,常在疾病的不同阶段表现出不同的证候,如大肠湿热型、肝郁脾虚型、脾肾阳虚型等,因此多采用不同的方剂进行治疗。黄芩汤源于《伤寒论》,用于治疗大肠湿热型泄泻较为对证;四神丸见于《证治准绳》,用于脾肾阳虚泄泻尤为适宜;痛泻要方载于《丹溪心法》,针对肝郁脾虚型泄泻疗效显著,上述三方均为临床治疗UC的常用名方。本实验在中医理论思想的指导下,通过构建UC动物模型,从炎症反应、脑肠轴调节、水运平衡及肠道菌群变化等角度综合对比黄芩汤、四神丸、痛泻要方用于UC动物模型的治疗作用,并探讨其相关作用机制。2.研究方法与结果2.1三种复方影响UC模型大鼠炎症反应的对比研究2.1.1大鼠行为学体征:利用TNBS混合乙醇造模法制备UC大鼠模型,按体重将大鼠随机分成正常(Normal)组、模型(Model)组、阳性药柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine,SASP)组、黄傮汤(HQT)组、四神丸(SSW)组、痛泻要方(TXYF)组。对除正常组外的其他组别大鼠进行造模,造模二天后灌胃给药,给药五天期间持续观察并记录各组大鼠行为学表现。根据行为学表现评价可知制备UC大鼠模型造模成功;HQT、SSW可改善大鼠行为学体征,具体表现为进食量增加、活动加快、精神状态好转,以HQT效果最为显著,TXYF组大鼠便溏现象无明显改善。与模型组相比,各组大鼠体重变化未见统计学差异。2.1.2病理组织学检测:对UC大鼠连续给药治疗五天后,解剖取结肠。显微镜下观察HE染色后的结肠组织,发现HQT、SSW给药后可减轻大鼠结肠组织病变情况,使结肠黏膜炎性浸润减少、腺体溃疡减少等,以HQT改善程度最为显著,TXYF组无明显改善。2.1.3 Elisa法测定UC大鼠血清内炎性因子变化:UC大鼠连续给药治疗五天后,眼眶取血,分离上层血清后,测定大鼠血清中IL-6、IL-8、PGE2、TNF-a水平。结果显示,模型组大鼠血清内炎性因子IL-6、IL-8、PGE2、TNF-α含量均显著高于正常组(P0.05)。与模型组相比,阳性药SASP组的IL-6、PGE2、TNF-α含量均降低(P0.05),IL-8水平降低最为显著(P0.01);HQT 组 IL-6、IL-8、TNF-a含量均降低(P0.05),PGE2 含量显著降低(P0.01);SSW组四种炎性因子含量均降低,但无统计学差异;TXYF组1L-6、TNF-α含量降低,IL-8、PGE2含量显著降低(P0.05)。结果证明HQT可显著降低大鼠体内IL-6、IL-8、PGE2、TNF-α含量,TXYF对IL-8、PGE2有抑制作用,SSW抑炎作用不显著。2.1.4 RT-PCR法检测UC大鼠结肠组织内Erkl、p38 mRNA表达:对UC大鼠持续给药治疗五天后,解剖取结肠,提取RNA进行RT-PCR检测。实验结果显示,与模型组相比,阳性药SASP组、HQT组、SSW组、TXYF组大鼠结肠内Erkl、p38mRNA表达都呈现显著降低趋势(P0.01),HQT组降低趋势最为显著。2.2联合运用Elisa法及免疫组化法检测UC大鼠结肠组织内脑肠肽变化UC大鼠连续给药治疗五天后,取眼眶血,解剖取结肠。Elisa法测定大鼠血清内5-HT含量。实验结果显示,与正常组相比,模型组大鼠血清内的5-HT含量显著降低(PO.01)。与模型组相比,阳性药和TXYF组5-HT含量明显升高(P0.05),HQT组、SSW组含量升高但无显著性差异。利用免疫组化法(Immunoh istochemistry,IHC)检测UC大鼠结肠内VIP、SP含量。关于VIP的实验结果表明,模型组大鼠结肠组织内的VIP含量相较于正常组出现显著性降低(PO.01)。与模型组相比,阳性药SASP组、HQT组、TXYF组VIP含量显著升高(PO.O 5),SSW组VIP含量升高但无统计学差异。SP结果显示与正常组相比,各给药组SP含量均降低,但未有显著统计学差异。与模型组相比,阳性药SASP组、HQT组、TXYF组SP含量显著升高(P0.05),SSW组SP含量升高但未见显著统计学差异。表明HQT可促进结肠内VIP、SP含量显著升高,还可促进5-HT含量升高,但无统计学差异;SSW有促进三种脑肠肽含量升高的作用,但未见统计学差异;TXYF可显著促进三种脑肠肽含量升高。2.3 Western-Blot法检测UC大鼠结肠组织水通道蛋白变化:UC大鼠连续给药治疗五天后,处死并解剖取结肠,提取蛋白后,检测结肠内AQP3、AQP4含量。所得实验数据表明,与正常组相比,模型组大鼠结肠内AQP3含量显著升高(P0.01)。与模型组相比,HQT组AQP3含量显著降低(P0.01);阳性药 SASP、SSW 组、TXYF 组 AQP3 含量下降(P0.05)。AQP4检测结果表明,与正常组对比,模型组中AQP4含量显著降低(P0.01)。与模型组相比,阳性药SASP组、HQT组中AQP4含量显著升高(P0.05);SSW组、TXYF组AQP4含量未见升高且无统计学意义。证明HQT可促进结肠组织内AQP3含量显著下降、AQP4含量显著升高;SSW可降低结肠组织内AQP3含量,对AQP4含量变化无明显作用;TXYF能降低结肠内AQP3含量,对AQP4未见明显作用。2.4 High-throughput sequencing 检测 UC 大鼠肠道菌群变化:UC大鼠连续给药五天后,取大鼠新鲜粪便,在16sMiseqPE300V3-4区段进行测序和分析。结果显示,此次测序微生物信息数据量与测序深度足够充分、样品物种分布较为均匀,绝大多数微生物信息能够被样本反映;3组复方中共有OTU数目为524个,其中共有OTU数目为207个;与模型组相比,SSW组菌群群落种类与模型组之间相似度较高,HQT、TXYF组菌群落群种类与模型组具有显著性差异;SSW组菌群群落物种丰富度最高,其次为HQT组,TXYF组菌群物种丰富度与模型组无显著差异;TXYF组组内样品间相似度最高,其次为SSW组,HQT组组内样品间差异较大;HQT组有益菌含量高于SSW组高于TXYF组;乳杆菌科(f-Lactobacillales)和链球菌科(f-peptostreptocaccaceae)为 SSW组显著差异菌群;普雷沃氏菌科(f-Prevotellaceae)、理研菌科(f-Rikenellaceae)、梭菌属(g-closlridium-inrtocuum-group)为TXYF组显著差异菌群;HQT组具有显著性差异的菌群为毛螺菌科(f-Lachnospiraceae)、瘤胃菌科(f-Ruminococcaceae)、大肠杆菌科(f-Gammaproteobacteria)、大肠杆菌科志贺菌属(g-Escherichia-Shigella)和紫单胞菌科(f-Porphyromonadaceae)。3.结论UC的病因至今尚未完全阐明,发病机制可能涉及炎症反应、脑肠轴互作、水运失调、肠道菌群紊乱等方面。三种名方在临床被广泛用于治疗UC,但每种方剂所针对的治疗机制及产生的治疗作用存在差异。黄芩汤适用于大肠湿热型泄泻,即在针对炎症、水运失调等方面疗效突出;四神丸对应于脾肾阳虚型泄泻,治疗作用侧重于调节菌群平衡、恢复肠道功能;痛泻要方对应肝郁脾虚所致泄泻,即通过调节情志、恢复脑肠轴平衡来达到诊疗目的。在世界范围内UC的发病率及患病率随着时间的延续而增加的当下,本文采用大肠湿热型泄泻模型,即现代临床对应的UC模型,通过测定炎性因子及相关介导炎症反应的通路、脑肠肽、水通道蛋白、肠道菌群等多个指标变量来对比三种复方在同一模型下的作用,以期更好的阐释UC发病机制,指导临床治疗用药。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
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