无花果叶中补骨脂素的绿色高效提取富集及纯化工艺研究

发布时间：2020-06-12 02:24

【摘要】：无花果叶在传统医学中已有上千年的使用历史,在长期的临床实践中发现具有很好的临床疗效,是一种重要的中药材。但是当前对其开发利用不足,更多的是作为无花果种植而伴生的农副产物,造成了极大的资源浪费。因此研究无花果叶的开发利用,可以增加无花果种植业的附加值和经济效益。补骨脂素具有很多重要的临床用途,无花果叶中含有丰富的补骨脂素及其前体补骨脂苷,以无花果叶为原料生产补骨脂素可以丰富原料来源,降低生产成本。当前对无花果叶中补骨脂素的提取分离研究还十分落后,缺乏高效的方法。为了更好的利用无花果叶,开发高效的从无花果叶中获取补骨脂素的方法,本论文主要做了以下三方面的工作:1.建立了定量分析无花果叶中补骨脂素和补骨脂苷的高效液相色谱方法:流动相:0.1%甲酸水(A)-乙腈(B);色谱柱:Luna C18(5 μm,250 mm × 4.6 mm i.d.);洗脱条件为:0-10 min,13-16%(B);10-11 min,16-17%(B);11-25 min,17%(B);25-55 min,17-65%(B);进样量:5μL;流速 1mL/min;检测波长:254nm;柱温30 ℃。该方法对补骨脂素和补骨脂苷在检测范围内,线性关系良好(R2 2 0.99),检出限分别为0.22和0.17 μg/mL,定量限分别为0.68和0.52μg/mL,精密度、重现性和稳定性均小于5%。加样回收率为97.88%～99.01%,R.S.D.均小于4%。结果表明该方法灵敏、准确、稳定,为无花果叶中补骨脂素和补骨脂苷的定量提供了方法。2.我们首次开发和优化了超声辅助的pH依赖基于离子液体的双水相体系提取富集技术,可以一步实现无花果叶中补骨脂苷高效转化为补骨脂素以及补骨脂素的提取和富集。并对工艺参数进行了优化,确定了最优的参数:离子液体酸水溶液组成:1-丁基-3-甲基咪唑溴盐、柠檬酸和水。提取和转化过程中最佳参数如下:pH:2.21,离子液体浓度:2.01 M,液固比:15.35 mL/g。纯化过程中最佳参数:1-丁基-3-甲基咪唑溴盐含量:37.04%wt柠檬酸含量,30.21%wt,pH:7.0。在上述最佳的工艺参数下,补骨脂素的提取率为31.22 mg/g(n=3),回收率为96.32%(n=3)。结果表明本研究所开发的方法可以通过调节体系的pH便可同时实现将补骨脂苷转化为补骨脂素和补骨脂素的提取富集。该方法将传统模式中生产天然产物的提取、转化和纯化三个独立的操作单元,仅仅通过调节pH而融合为一个过程中,具有提取率高、成本低和操作简单等特点。3.建立了高速逆流色谱纯化无花果叶中和补骨脂素和佛手柑内酯的方法:佛手柑内酯是无花果叶子提取物中的主要成分之一,本部分研究以石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂萃取上述提取富集溶液以获得补骨脂素和佛手柑内酯的分离样品。通过筛选得到了最适于分离补骨脂素和佛手柑内酯的溶剂体系,其组成为:正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(7:3:5:5;v:v:v)。当转速800 rmp、流速2 mL/min和上样量200 mg时,一次制备可以得到40.93 mg补骨脂素和4.09 mg佛手柑内酯。高效液相色谱分析结果表明分得的补骨脂素的纯度为97.9%,回收率为99.1%,每克无花果叶中补骨脂素的得率为3.01%。佛手柑内酯的纯度为96.76%,回收率为98.8%,每克无花果叶中佛手柑内酯的得率为0.644%。与常规分离方法相比,高速逆流色谱具有操作简单、分离时间短、得到的化合物纯度高、回收率高、在制备过程中化合物不易分解的优点。由以上结果可知,在本文所建立和优化的超声辅助的pH依赖基于离子液体的双水相体系提取富集技术结合高速逆流色谱制备技术,可以制备得到的补骨脂素的纯度为97.9%,每克无花果叶中补骨脂素的得率为3.01%,得到的佛手柑内酯的纯度为96.76%,每克无花果叶中佛手柑内酯的得率为0.644%。本研究有利于无花果叶的开发和利用,也为天然产物的绿色提取和分离提供了新思路。
【图文】：

无花果叶,提取物

．．流动相：０．１邋％甲酸水溶液（Ａ），乙腈（Ｂ）；洗脱梯度：０－１０邋ｍｉｎ，邋１３－１６邋％邋Ｂ；逡逑１０－１１邋ｍｉｎ，邋１６－１７邋％邋Ｂ；邋１１－２５邋ｍｉｎ，１７邋％邋Ｂ；邋２５－５５邋ｍｉｎ，邋１７－６５邋％邋Ｂ；进样量：５邋ｐＬ；流逡逑速：ｌｍＬ／ｍｉｎ；检测波长：２５４ｎｍ，柱温：３０邋°Ｃ。逡逑２．２结果与讨论逡逑２．２．１色谱条件的优化逡逑为了使样品中补骨脂素和补骨脂苷达到基线分离，首先对色谱条件进行了优化。流逡逑动相及洗脱梯度对样品的分离有很大的影响，，为了选择最佳的流动相，分别对乙腈－逡逑水、甲醇－水以及其分别加入甲酸和四氢呋喃后对分离的影响进行了考察。发现０．１邋％甲逡逑酸－水及乙腈作为流动相时，对样品的分离效果好，峰型尖锐对称，因此作为流动相。逡逑为了进一步优化分离效果，对洗脱梯度进行了优化，得到了最佳的洗脱梯度：０－１０ｍｉｎ，逡逑１３－１６邋％邋Ｂ；邋１０－１１邋ｍｉｎ，邋１６－１７邋％邋Ｂ；邋１１－２５邋ｍｉｎ，邋１７邋％邋Ｂ；邋２５—５５邋ｍｉｎ，邋１７－６５邋％邋Ｂ。检测波长逡逑对分析的灵敏度有很大的影响，通过查阅文献发现补骨脂素和补骨脂苷在２５４邋ｎｍ下吸逡逑光系数较大，因此在本文中选择２５４邋ｎｍ作为检测波长。在柱温为３０邋°Ｃ，流速为１逡逑ｍＬ／ｍｉｎ时，按上面确定的条件对样品进行了检测，结果发现补骨脂素和补骨脂苷都达逡逑到了基线分离，且峰型尖锐对称，如图２－１所示。逡逑

补骨脂素,无花果叶,离子液体,提取率

补骨脂素而增加补骨脂素的提取率，我们选择与柠檬酸（ｐＨ＝２）组成的混合逡逑溶剂作为提取溶剂，并选择［Ｂｍｉｍ］Ｂｒ，乙醇，乙醇加柠檬酸（ｐＨ＝２）作为对照进行试逡逑验。结果如图３－４所示，对比［Ｂｍｉｍ］Ｂｒ和［Ｂｍｉｍ］Ｂｒ加梓檬酸（ｐＨ＝２），补骨脂苷的提逡逑取率从９．７６邋ｍｇ／ｇ降低到０．０９８邋ｍｇ／ｇ，而补骨脂素的提取率从２０．８９邋ｍｇ／ｇ增大到３０．２１逡逑ｍｇ／ｇ。对比乙醇和乙醇加柠檬酸（ｐＨ＝２），补骨脂苷的提取率从１５．３２邋ｍｇ／ｇ降低到逡逑１０．１１邋ｍｇ／ｇ，而补骨脂素的提取率从８．２１邋ｍｇ／ｇ增大到１２．３４邋ｍｇ／ｇ。这些结果表明，酸的逡逑加入可以将补骨脂苷转化为补骨脂素，增大补骨脂素的提取效率。相比于乙醇加柠檬酸逡逑（ｐＨ＝２），［Ｂｍｉｍ］Ｂｒ加柠檬酸（ｐＨ＝２）的转化效率更高，由于其更强的催化能力和溶解能逡逑力。加柠檬酸（ＰＨ＝２）体系是最佳的提取无花果叶中补骨脂素溶剂体系。逡逑３５－１逦ｍｉ邋Ｐｓｏｒａｌｅｎ逡逑Ｂ邋３0－逦丁逦Ｉ＊邋ｐｓｏｒａｌｉｃ邋ａｃｉｄ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ逡逑图３－４酸的加入对无花果叶中补骨脂苷的转化和补骨脂素提取率的影响逡逑Ｆｉｇ．邋３－４邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ａｃｉｄ邋ｏｎ邋ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｐｓｏｒａｌｉｃ邋ａｃｉｄ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ邋ｉｎｔｏ邋ｐｓｏｒａｌｅｎ邋ａｎｄ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｐｓｏｒａｌｅｎ邋ｆｒｏｍ逡逑ｆｉｇ邋ｌｅａｖｅｓ逡逑？邋２３－逡逑
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284.2

【参考文献】