玉郎伞MHBFC的分离及其对eNOS基因敲除小鼠心室重构的作用

发布时间：2020-06-12 00:57

【摘要】：目的:研究壮药玉郎伞(YLS)石油醚部分中17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮(MHBFC)的分离,及其对eNOS基因敲除小鼠压力超负荷心室重构的作用,以期为该药在临床应用方面提供理论和实验依据。方法:(1)玉郎伞MHBFC的分离取YLS干燥根的饮片,用70%乙醇进行提取,再用石油醚、乙酸乙酯萃取,待萃取完毕后分别将萃取液合并减压浓缩,得到石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物。采用硅胶柱层析色谱法(200-300目),将石油醚萃取物进行梯度洗脱,收集流分,TLC检识后将相同流分合并,减压浓缩后将粗产品再次进行硅胶柱层析和重结晶,并通过IR、1H NMR、13C NMR及X-射线单晶衍射检测,最后鉴定得到3个单体化合物(其中化合物1为MHBFC)。(2)心室重构模型的建立将野生型C57BL/6j小鼠和eNOS基因敲除小鼠按体重(BW)随机分为手术组和假手术组,用4%的水合氯醛(0.1ml/10g)腹腔注射进行麻醉,小鼠右侧卧位,于左肋骨下方,大腿上方纵行切开约1cm,找到腹主动脉,手术组小鼠用24号针头平行放于腹主动脉上方,6-0号线将针头和腹主动脉一起结扎,当看到肾脏由鲜红色变为灰白色时,迅速拔出结扎针头,此时,腹主动脉被缩窄成与24号针头一样粗细的大小;假手术组小鼠只游离腹主动脉,不进行结扎。最后用4-0号线将小鼠的伤口缝合,再次消毒后,将小鼠放回笼中静待苏醒。(3)术后分组、给药及指标检测术后第4天,将手术组存活的野生型小鼠按体重随机分为3组,每组10只,加上假手术组小鼠,一共4组,分别为:假手术组;模型组;MHBFC 24mg/kg组;MHBFC 12mg/kg组。同理,将eNOS基因敲除小鼠根据相同的方法进行分组。动物分组后灌胃给药,假手术组和模型组灌胃给予等体积的0.5%CMC-Na溶液,每天1次,连续6周。于给药后1,3,5周采用多通道生物信号分析系统观测小鼠的血压(SBP)和心率(HR)。实验完成后,采集相关标本,用ELISA法测定小鼠血浆中白介素-6(interleukin-6,IL-6)的水平,HE染色观察心脏和血管的病理学改变,Masson’s染色观察心脏胶原沉积的情况,透射电镜观察心脏超细微结构的变化,免疫组化法检测心脏组织中内皮素-1(endothelin-1,ET-1)的表达,RT-PCR法检测心脏组织中心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、β-肌球蛋白重链基因(β-myosin heavy chains,β-MHC)心房脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、及血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A,SAA)的m RNA的表达。结果:(1)从YLS石油醚萃取部分中分离得到3个化合物:化合物1为MHBFC,桔色方晶,分子式为C18H14O4,相对分子质量为294.30;化合物2为水黄皮素,白色针晶,分子式为C18H12O4,相对分子质量为292.30;化合物3为2″,2″-二甲基-吡喃-[5″,6″:8,7]黄酮,白色针晶,分子式C20H16O3,相对分子质量为304.34。这3个化合物均为首次从YLS石油醚萃取部分中分离得到。(2)MHBFC对SBP、HR的影响:经MHBFC治疗后,与模型组相比,野生型小鼠的SBP和HR均显著降低(P0.05),eNOS基因敲除小鼠的SBP及HR没有显著性差异。(3)MHBFC对脏器指数的影响:经药物治疗后,与模型组相比,野生型小鼠MHBFC 24 mg/kg组的心脏、左心室、右心室、肺脏、肾脏重量指数均显著下降,但是eNOS基因敲除小鼠的心脏、左心室、右心室、肺脏、肾脏重量指数没有显著性差异。(4)MHBFC对炎症因子IL-6的影响:与模型组相比,野生型小鼠MHBFC 24 mg/kg组血浆中IL-6的水平显著降低(P0.01),eNOS基因敲除小鼠的IL-6水平没有显著性差异。(5)MHBFC对心肌细胞及心肌胶原沉积的影响:与模型组相比,野生型小鼠MHBFC治疗组的心肌细胞面积、心肌间质胶原容积分数(CVF)及心肌血管周围胶原面积(PVCA)均显著降低(P0.01,P0.01,P0.01),eNOS基因敲除小鼠的心肌细胞面积、CVF及PVCA无显著性变化。(6)MHBFC对血管重构的影响:经MHBFC治疗后,野生型小鼠MHBFC 12 mg/kg和MHBFC 24 mg/kg组的血管肥厚程度均显著降低(P0.05及P0.05),血管横截面积显著下降(P0.05及P0.01),血管厚度显著降低(P0.01及P0.01),血管半径、内半径、外半径均显著下降(P0.05);eNOS基因敲除小鼠各血管重构指标均有所下降,但是与模型组相比没有显著性差异。(7)MHBFC对BNP、β-MHC、ANP、SAA m RNA以及ET-1蛋白的影响:与模型组相比,野生型小鼠MHBFC治疗组的4个基因以及ET-1蛋白的表达量均显著下降,eNOS基因敲除小鼠4个基因的表达量以及ET-1蛋白的表达量均无显著性变化。(8)MHBFC对心肌超微结构的影响:野生型小鼠模型组的线粒体体积明显变大、不与心肌纤维平行、排列紊乱、偶见坏死线粒体,Z线模糊,心肌纤维溶解断裂,甚至变成点状。经过MHBFC治疗后,症状明显改善,线粒体平行于心肌纤维排列,Z线清晰。eNOS基因敲除小鼠各组的线粒体体积均明显增大、数量增多、且出现大面积坏死,偶见线粒体空泡,Z线模糊,心肌纤维断裂溶解,形状各异。经MHBFC治疗后,给药组小鼠的心肌超微结构没有得到明显的改善。结论:(1)MHBFC存在于YLS石油醚萃取部分中,分离方法简单且产率高。(2)MHBFC 12,24 mg/kg具有明显逆转野生型小鼠心室重构的作用,但是对逆转eNOS基因敲除小鼠心室重构的效果不明显。(3)MHBFC逆转心室重构的作用机制与eNOS基因有关,其对小鼠心室重构的逆转作用依赖于eNOS基因。
【图文】：

苯并呋喃,查尔酮,甲氧基,羟基

该种属植物主要生长在热带及亚热带在我国，则主要分布在西南部及台湾，伞药理作用较多，且成分复杂，其中，M 年首次从其根部的乙酸乙酯萃取物中分且产率低，为提高产率，本研究采用与留石油醚萃取液，，通过对石油醚萃取部发现其它的化合物。本课题组前期研究12]、抑制心肌细胞凋亡[13]和改善心肌缺血心室重构的进程中，可以改善 eNOS-NO从而提高 eNOS 的表达，但是其逆转心因还尚未清楚。

最大吸收波长,化合物,图谱,基因敲除

玉郎伞 MHBFC 的分离及其对 eNOS 基因敲除小据2 有两个最大吸收波长，分别为 UV-vis(DMSO)λm物 3 只有一个最大吸收波长，为 UV-vis(DMSO)λm图 2 所示：
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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