山豆根主要活性成分的保肝抗病毒作用及免疫学机制研究

发布时间：2020-06-13 01:00

【摘要】：乙型病毒性肝炎(Hepatitis B Virus,HBV)感染带来严重的社会问题。乙肝感染进一步发展易进展为肝纤维化或者肝癌导致极高的死亡率,给社会发展造成严重威胁。乙肝的发病机制非常复杂,现有的研究已经证明乙肝病毒并不直接导致肝细胞损伤,机体对抗原不断的免疫应答是造成肝损伤的主要原因。在机体抗病毒免疫中,T淋巴细胞是机体免疫应答的重要细胞。有很多学者指出,宿主对HBV抗原耐受主要是由于CD4 T淋巴细胞功能不足或缺陷引起的。因此,研究机体的免疫调节作用,尤其是对CD4 T淋巴细胞的调节作用给乙肝的治疗提供了新的方向和策略。在我国,多年来传统中药在治疗肝炎时已得到广泛应用。中药山豆根始载于唐代《开宝本草》,主要功效是清热解毒,利咽消肿。近代临床常用于治疗咽炎黄疸,心律失常等病症。山豆根主要成分包括生物碱、黄酮、三萜、多糖等。其中生物碱是山豆根主要活性成分,也是其药效的物质基础。山豆根生物碱包括以下四种类型:苦参碱型、金雀花碱型、奥豆碱型(鹰爪豆碱型)和羽扇豆碱型。大量文献报道氧化苦参碱具有抗病毒,调节免疫,改善炎症状态等药理作用。最近有研究表明,氧化苦参碱可以抑制Hep G2.2.15细胞和转基因小鼠HBV的复制,抑制HBs Ag和乙型病毒性肝炎e抗原(Hepatitis B e Antigen,HBe Ag)的表达。氧化苦参碱被证实在清除血清HBe Ag和HBV DNA方面有类似干扰素-α的作用。而槐果碱被证实具有抗柯萨奇B病毒作用及免疫调节功能。本研究以免疫健全的HBV水动力小鼠模型为实验模型,以氧化苦参碱为研究对象对其抗病毒作用及免疫学机制进行研究;以刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)诱导的小鼠免疫性肝损伤模型为实验模型,以槐果碱为研究对象对其保肝抗炎作用及机制进行研究,以扩大山豆根活性成分的现代临床应用。第一部分基于HBV水动力模型的氧化苦参碱抗病毒作用及免疫学机制研究目的:研究氧化苦参碱对HBV水动力小鼠的抗病毒作用及免疫学机制。方法:1.通过尾静脉快速注射约小鼠体积10%质粒的含质粒生理盐水溶液建立慢性HBV感染小鼠模型。2.通过检测HBV DNA复制水平,HBs Ag、HBe Ag、乙型病毒性肝炎核心抗原(Hepatitis B core Antigen,HBc Ag)的表达,评价氧化苦参碱对HBV的清除作用。3.根据酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法检测血清干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)炎症因子的表达。根据流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞及其细胞因子比例的变化,以探讨氧化苦参碱抗病毒的免疫学机制。结果:1.与模型组相比,恩替卡韦可以显著促进HBV DNA转阴,恩替卡韦给药1,3,6周显著抑制HBV DNA复制。氧化苦参碱20 mg·kg~(-1)给药第3,6周可有效抑制HBV DNA复制。而氧化苦参碱2.2 mg·kg~(-1)和6.7mg·kg~(-1)在抑制HBV DNA复制方面效果不明显。2.与模型组氧化苦参碱20 mg·kg~(-1)可以显著促进HBs Ag,HBe Ag和肝内HBc Ag的清除,而恩替卡韦对HBs Ag清除效果不显著。氧化苦参碱20 mg·kg~(-1)在清除HBe Ag和肝内HBc Ag的表达方面效果优于恩替卡韦。3.ELISA结果显示,氧化苦参碱6.7 mg·kg~(-1)和20 mg·kg~(-1)可明显促进小鼠血清IFN-γ表达,而对TNF-α表达无影响。4.流式细胞术结果显示,氧化苦参碱剂量依赖性地促进CD4+T细胞分泌IFN-γ而不影响白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)比例。结论:1.氧化苦参碱可促进模型小鼠HBV DNA的清除,但药理作用相对较弱。2.氧化苦参碱可显著抑制HBs Ag、HBe Ag和肝内HBc Ag表达,其效果优于恩替卡韦。3.氧化苦参碱对HBV的清除作用与其促进CD4+T细胞分泌IFN-γ相关。第二部分槐果碱对Con A诱导的小鼠肝损伤的保护作用及免疫学机制研究目的:基于Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤模型探讨槐果碱对其保护作用及机制。方法:1.BALB/c小鼠预先以槐果碱和双环醇连续灌胃给药5天,空白组以生理盐水灌胃。末次给药30分钟后,除空白组外,其余小鼠尾静脉注射15 mg·kg~(-1)Con A,构建小鼠免疫性肝损伤模型。2.通过小鼠血清天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)肝脏病理切片及TUNEL染色评价槐果碱对小鼠免疫性肝损伤的保护作用。3.根据ELISA、实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR),流式细胞术及蛋白免疫印迹法探讨槐果碱的保肝抗炎作用及免疫学机制。结果:1.与空白组相比,模型组ALT、AST、TBIL表达显著升高。与模型组相比,槐果碱给药组可以显著抑制血清ALT、AST和TBIL的异常升高。肝脏病理切片和TUNEL染色显示,槐果碱给药组可有效抑制肝脏炎症细胞浸润和肝细胞凋亡坏死。2.RT-PCR数据显示,槐果碱可以抑制肝脏趋化因子和黏附因子巨噬细胞炎性蛋白~(-1)α(Macrophage inflammatory protein~(-1)α,MIP~(-1)α)、CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10,CXCL10)和细胞间黏附分子~(-1)(Intercellular adhesion molecule~(-1),ICAM~(-1))m RNA的表达。3.ELISA结果显示,槐果碱可以显著抑制IFN-γ和TNF-α的表达,且对IFN-γ的抑制呈剂量依赖性。4.流式细胞术结果显示,槐果碱可以降低脾淋巴细胞IFN-γ的比例。5.进一步机制研究表明,槐果碱通过上调细胞因子信号传导抑制因子1(Suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1)表达抑制信号传导与转录活化因子1(Signal transducers and activators of transcription1,STAT1)的激活抑制Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤。结论:1.槐果碱对Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤具有保护作用。2.槐果碱可以抑制肝脏趋化因子和黏附因子MIP~(-1)α、CXCL10和ICAM~(-1) m RNA的表达。3.槐果碱可以抑制血清和脾淋巴细胞IFN-γ的表达。4.槐果碱通过上调SOCS1表达抑制STAT1的激活,抑制Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤。5.槐果碱对Con A诱导的小鼠免疫性肝损伤的保护作用与其抑制IFN-γ/STAT1信号通路相关。
【学位授予单位】：承德医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】