胡桃楸茎枝水提物的体外吸收与代谢研究

发布时间：2020-06-13 03:43

【摘要】：目的:胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)又名山核桃、核桃楸,为胡桃科胡桃属植物。在《辽宁省中药标准》中,记载了胡桃楸的根皮、树皮和果皮具有抗肿瘤作用,同时民间也记载口服胡桃楸水煎液治疗恶性肿瘤。已有文献研究报道了胡桃楸不同部位有机溶剂提取物在体内外的抗肿瘤作用,但对胡桃楸水提物的研究较少。本课题组已经从胡桃楸茎枝、果、叶和根中分析鉴定了100余种化合物。为了进一步明确胡桃楸水煎液口服后能够吸收入体内的成分,本论文在课题组前期研究结果的基础上,对胡桃楸茎枝水提物的体外抗肿瘤作用,及其体外吸收、代谢的成分进行了研究。为胡桃楸的药效物质基础研究奠定了基础。材料与方法:1.材料1.1本论文所研究的药材样品胡桃楸茎枝,采摘于辽宁省大连市普兰店莲山镇,趁鲜切片、冷冻干燥。1.2实验动物SD大鼠,雄性,购于辽宁长生生物技术有限公司。大鼠饲养于辽宁中医药大学动物实验中心空气层流架SPF级环境中。1.3 Caco-2细胞购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司,来自于人源结肠癌组织。人胃癌细胞(HGC-27)购自上海博古生物科技有限公司,来自于人源未分化胃癌;高分化人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)购自上海细胞库。2.方法2.1胡桃楸茎枝水提物的制备及化学成分研究:采用热回流和真空冷冻干燥的方法制备胡桃楸茎枝水提物冻干粉。以UHPLC-MS/MS分析和鉴定胡桃楸茎枝水提物中的化学成分。2.2体外抗肿瘤作用和毒性研究:分别以胡桃楸茎枝水提物对人胃癌细胞(HGC-27)和高分化的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的增殖抑制作用作为评价指标,采用MTT比色法评价胡桃楸水提物对HGC-27和SH-SY5Y细胞形态和相对增殖率(RGR)的影响,进而评价胡桃楸茎枝水提物对肿瘤细胞的选择性抑制作用。2.3 Caco-2细胞模型中吸收和代谢研究:采用MTT比色法评价胡桃楸茎枝水提物对Caco-2细胞的相对增殖抑制率,判断细胞毒性,确定给药浓度;采用胡桃楸茎枝水提物与Caco-2细胞共培养,将一定浓度的胡桃楸茎枝水提物作用于Caco-2单层细胞,收集细胞破碎液,通过UHPLC-MS/MS联用技术分析和鉴定Caco-2细胞中吸收和代谢的成分。2.4大鼠离体外翻肠囊模型中吸收和代谢研究:以乳酸脱氢酶(LDH)评价大鼠离体外翻肠段的活性,以确定大鼠离体外翻肠囊模型的取样时间和给药浓度;应用UHPLC-MS/MS分析和鉴定胡桃楸茎枝水提物在十二指肠、空肠和回肠中吸收和代谢的成分。2.5没食子酸和逆没食子酸的体外人肝微粒体代谢研究:选用人源肝微粒体,模拟人体内环境,以对照药物非那西丁的代谢确定肝微粒体活性、优化孵育条件;通过UHPLC-MS/MS分析鉴定胡桃楸水提物中主要成分没食子酸和逆没食子酸在人肝微粒体孵育体系中的代谢产物。结果:1.胡桃楸茎枝水提物的制备及化学成分研究:胡桃楸茎枝水提物冻干粉的得率为12.5%,计算生药量为8 g·g~(-1)。共鉴定了胡桃楸茎枝水提物中99个成分,包括53个鞣质、33个有机酸、10个萘烷衍生物、2个氨基酸和1个黄酮。2.体外抗肿瘤作用和毒性研究:在体外抗肿瘤作用与毒性研究中,加入不同浓度胡桃楸茎枝水提物后,当浓度≤0.1 mg·mL~(-1)时,对HGC-27和SH-SY5Y细胞未显示细胞毒性;当浓度达0.5 mg·mL~(-1)时,胡桃楸茎枝水提物对HGC-27细胞的RGR为51.48%,有明显的细胞毒性;此时对SH-SY5Y细胞无细胞毒性。当浓度达1.0mg·mL~(-1)时,胡桃楸茎枝水提物对HGC-27细胞的RGR为45.45%,有明显的细胞毒性;SH-SY5Y细胞的RGR为88.16%,仍无细胞毒性。3.Caco-2细胞模型中吸收和代谢研究:在胡桃楸茎枝水提物对Caco-2细胞毒性研究中,浓度在0.2~2.0 mg·mL~(-1)范围内,Caco-2细胞的相对增殖抑制率均75%,细胞毒性均≤1,说明在该浓度范围内,胡桃楸茎枝水提物对Caco-2细胞无毒性作用,故选定在Caco-2细胞吸收模型中胡桃楸茎枝水提物浓度为0.8 mg·mL~(-1)。最终分析鉴定了胡桃楸茎枝水提物在Caco-2细胞模型中吸收的成分2个,分别为柠檬酸和没食子酸,代谢的成分1个,推测为二甲氧基苯甲酸,代谢途径为去羟基及甲基化。4.大鼠离体外翻肠囊模型中吸收和代谢研究:以LDH释放量为指标,确定大鼠离体外翻肠囊模型的取样时间为150 min,胡桃楸茎枝水提物的给药浓度为0.005 g·mL~(-1)(以生药计)。分析鉴定了胡桃楸茎枝水提物在十二指肠、空肠和回肠中吸收成分共41个,包括鞣质(13个)、有机酸(16个)、萘烷(9个)、二芳基庚烷(2个)和木脂素(1个)五类化合物。鉴定了十二指肠、空肠和回肠中代谢的成分共11个,其中10个为与葡萄糖醛酸结合的产物、1个为硫酸酯化产物。其原形成分包含了胡桃楸茎枝水提物中的鞣质类成分3个,有机酸类成分2个,萘烷类成分6个。5.没食子酸和逆没食子酸的体外人肝微粒体代谢研究:建立的肝微粒体孵育体系能够将非那西丁代谢为对乙酰氨基酚,代谢率约为74.89%,说明在试验条件下,人源肝微粒体有生物活性。继而研究了没食子酸和逆没食子酸在该孵育体系中的代谢,结果未发现两者的代谢产物,但发现加入没食子酸和逆没食子酸后能够使孵育体系中的成分发生变化。结论:1.胡桃楸茎枝水提物中成分主要为鞣质、有机酸、萘烷衍生物等。2.胡桃楸茎枝水提物在体外对肿瘤细胞的增殖具有选择性抑制作用。3.胡桃楸茎枝水提物中主要成分:鞣质、有机酸和萘烷衍生物能够通过小肠壁或Caco-2细胞壁而被吸收。小肠壁代谢酶主要使吸收成分发生葡萄糖醛酸化代谢反应。4.初步推测没食子酸和逆没食子酸在体外代谢模型中不发生代谢反应。
【图文】：

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胡桃楸水提物的体外吸收与代谢研究上述实验方法加热回流 1 h，收集水煎煮液，过滤残渣，共重复两次，最后一次用 500 mL纯净水润洗饮片，合并 3 次水煎煮液和润洗液后，经布氏漏斗真空抽滤得到的滤液，再用减压旋转蒸发仪（60 ℃）减压浓缩至 60 mL，将浓缩液于-80 ℃冷冻 12 h，用真空冷冻干燥机（-50 ℃，10 pa）干燥 48 h，，即得胡桃楸茎枝水提物冻干粉，称量重量为 25 g，简称冻干粉。其制备流程如下图 1-1 所示。

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辽宁中医药大学 2019 届硕士学位论文出来，每次称取 200 g 冻干饮片，共提取 3 次，得到红棕色水提物冻干粉共 75 g，计算冻干粉的得率为 12.5%，即胡桃楸茎枝水提物冻干粉生药量为 8 g/g。再分别通过UHPLC-DAD 检测技术，在 270 nm 处测定随机两个批次的胡桃楸茎枝水提物冻干粉的成分，色谱图结果如图 1-2 所示，表明随机两批次的水提物冻干粉在相同条件下测定的成分相同且稳定、重复性较好，实验室提取胡桃楸茎枝水提物的制备流程方法可行。胡桃楸茎枝水提物中化学成分鉴定详见论文二第二节的内容。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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