基于抗炎活性的葛根芩连片整体中药生物药剂学分类系统研究

发布时间：2020-06-14 08:40

【摘要】：目的:口服药物产生疗效的重要前提是经过肠吸收。生物药剂学分类系统(BCS)作为一种预测口服药物肠吸收情况的有效工具,通过联合研究药物的水溶解性和肠渗透性等影响成药性的核心指标,判断药物在口服吸收时是否可能出现生物利用度问题,在指导新药研发和剂型设计、预测药物体内外相关性及生物等效性豁免研究等方面应用广泛。在BCS理论基础上发展起来的中药生物药剂学分类系统(CMMBCS)是一种以吸收为核心,同时结合中药临床疗效实际,通过探索多成分环境下的溶解性和渗透性结果及变化规律挖掘出中药成分吸收的本质特色属性,从而对中药进行分类的科学框架。CMMBCS研究最终应落实到中药复方整体研究层面,而中药多成分多靶点的整体作用特点决定了其整体吸收情况不是由内含成分的溶解度和渗透性参数的简单加和可以阐释清楚的。鉴于研究口服药物肠吸收的目的是将其与药效相关联,本文以中药复方制剂葛根芩连片为研究对象,以其抗炎功效为导向,在初步锁定具有抗炎活性的代表性成分后,不仅对葛根芩连片中代表性成分进行了溶解度和渗透性研究,还综合考虑各成分的质量权重和药效权重,对各成分的溶解度和渗透性数据进行校正和整合,最终获得能够表征葛根芩连片整体吸收情况的生物药剂学参数。本文对中药复方整体CMMBCS研究进行初步探索,补充和完善了CMMBCS理论框架,并为其进一步发展提供数据支撑及研究基础,将有助于中药复方质控成分的选择和中药制剂工艺的改进。方法:利用中药成分数据库及分子对接技术,结合文献统计、药典记载,同时兼顾生物活性和含量高低初步筛选葛根芩连片中具有抗炎活性的代表性成分;利用脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞构建体外炎症模型,以TNF-α和IL-6为靶点,考察葛根芩连片中代表性成分的抗炎作用,得到各成分的药效权重;建立葛根芩连片中代表性成分的含量测定方法,得到各成分的质量权重;通过经典摇瓶法和在体单向肠灌流法分别测定葛根芩连片中代表性成分在不同介质中的溶解度和有效渗透系数,并采用质量权重和药效权重相结合的方法将其整合。结果:(1)分子对接结果显示葛根芩连片四味药材中与TNF-α和IL-6结合活性较强的成分占总成分比例较高,在54.55%～78.04%之间,葛根芩连片整体抗炎活性较强,且其抗炎机制与TNF-α和IL-6两个靶点有重要关联;结合文献检索、药典记载,同时兼顾生物活性和含量,确定葛根素、大豆苷、黄芩苷、大豆苷元、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸、黄连碱、表小檗碱、小檗碱、巴马汀12个成分为葛根芩连片CMMBCS研究中的代表性成分;经体外细胞实验验证,该12个成分对LPS诱导RAW264.7细胞分泌的TNF-α和IL-6有不同程度的抑制作用,转化成药效权重分别为0.04,0.12,0.10,0.13,0.05,0.10,0.04,0.04,0.07,0.10,0.10,0.11,且12个成分的混合物与葛根芩连片提取物的整体药效作用相比无显著性差异,代表性成分的选择具有一定合理性。(2)不同厂家及批号的葛根芩连片中均可检测到12个代表性成分,但各成分的比例有所不同且成分之间含量相差悬殊,为便于葛根芩连片整体环境下的多成分溶解度和渗透性同时检测和准确定量,最终选取主要成分整体含量相对较高的吉林万通药业批号为20170501的葛根芩连片作示范,并确定12个成分的质量权重分别为0.33,0.06,0.19,0.03,0.04,0.06,0.02,0.02,0.02,0.02,0.17,0.04。(3)采用夹角余弦法分析得到葛根芩连片中葛根素、大豆苷、大豆苷元、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素两两之间的溶解趋势较为相似,均在pH4.0缓冲溶液中溶解度最小,且在pH4.0～pH7.4缓冲溶液中,随着pH值增加,溶解度逐渐增加;黄芩素和盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀的溶解趋势较为相似,均在pH1.0缓冲溶液中溶解度最大;而甘草酸溶解度具有pH依赖性,随着pH值增加,其溶解度也逐渐增加;对比发现,12个成分在单一及葛根芩连片整体环境下的溶解趋势变化较大,说明复方环境对单一成分的溶解度影响较大,具体机制有待进一步探索;通过各成分溶解度数据计算其剂量数D0,结果显示D0值均大于1,且结合质量权重和药效权重进行加权计算后得到葛根芩连片整体D0值为6.34,属于低溶解度。(4)分析葛根芩连片中12个成分在高、中、低不同药物浓度下吸收参数的差异,可知各成分的吸收分数均较低,在3%～20%之间;各成分的吸收机制主要是被动扩散,其中大豆苷、黄芩素、汉黄芩苷的吸收可能还伴有主动转运过程。除大豆苷、黄芩素、汉黄芩素的有效渗透系数Peff高于5×10-5 cm·s-1外,其余成分均小于5×10-5 cm·s-1,经加权计算后,葛根芩连片整体的Peff值为3.826×10-5cm·s-1,属于低渗透性。并分别计算葛根芩连片中12个成分及整体的最大吸收剂量MAD,其中葛根素、大豆苷、黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱的MAD值较高,吸收相对较好,但葛根芩连片整体MAD为68.49 mg,低于临床剂量,吸收百分比F仅有38.41%。结论:葛根芩连片的抗炎机制可能与抑制TNF-α和IL-6的分泌量有关。从吸收角度,可将葛根素、大豆苷、黄芩苷、汉黄芩苷、盐酸小檗碱等吸收较好成分作为葛根芩连片质量控制的重要指标成分。基于抗炎活性可将葛根芩连片归属为CMMBCS IV类药物,其整体吸收较差,溶解度和渗透性均是其吸收的主要限制因素,意味着可能需要采取相应的制剂手段提高溶解度或渗透性以改善其吸收,进而提高其临床疗效。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R283.6
【图文】：

示意图,三维结构,配体,示意图

最终选取ＴＮＦ－ａ和ＩＬ－６作为靶蛋白，相应的靶蛋白三维结构从ＰＤＢ数据库获取，逡逑其中邋ＴＮＦ－ａ邋的邋ＰＤＢ邋编号为邋２ＡＺ５（ＬｉｇａｎｄＩＤ邋为邋３０７）；邋ＩＬ－６邋的邋ＰＤＢ邋编号为邋ｌＡＬＵＣＬｉｇａｎｄ逡逑ＩＤ为ＴＬＡ），其三维结构及配体和受体相互作用示意图见图１。逡逑表１与炎症疾病相关的４个靶蛋白逡逑基因逦蛋白名称逦ＰＤＢ号逦核准药物逡逑Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ逡逑Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ逡逑Ａｍｒｉｎｏｎｅ逡逑Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ邋ｐｅｇｏｌ逡逑Ｐｏｍａｌｉｄｏｍｉｄｅ逡逑Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ逡逑ＴＮＦ逦Ｔｕｍｏｒ邋Ｎｅｃｒｏｓｉｓ邋Ｆａｃｔｏｒ逦２ＡＺ５邋Ｐｓｅｕｄｏｅｐｈｅｄｒｉｎｅ逡逑Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ逡逑Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ逡逑Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ逡逑Ａｐｒｅｍｉｌａｓｔ逡逑Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ逡逑Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ逡逑Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ逡逑Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ逡逑ＩＬ６逦Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ邋６逦１ＡＬＵ逦Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ逡逑３５逡逑

葛根芩连片,成分,细胞活力,细胞存活率

逦９４．４４±２．８１逡逑３．２葛根芩连片中１２个单体成分对ＲＡＷ２６４．７细胞活力的影响逡逑如图２所示，１００邋ｐＭ葛根素、大豆苷、黄芩苷、大豆苷元、汉黄芩苷、黄芩素、逡逑汉黄芩素、甘草酸、盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀对ＲＡＷ２６４．７逡逑细胞活力均无影响（细胞存活率在９０％以上）。因此，在后续试验中，可将１２成分的逡逑浓度控制在〗００邋ＨＭ。逡逑１４０逡逑丨ｌｉｉ逡逑图２葛根芩连片中Ｉ２个单体成分对ＲＡＷ２６４Ｊ细胞存活率的影响（？＝３）逡逑３．３葛根芩连片提取液及１２个成分同比例混合溶液对ＲＡＷ２６４．７细胞活力的影响逡逑按２．１．２项下方法制备浓度为ｌｍｇｉｍＬ／１邋（以葛根芩连片原重量计）的葛根芩连片提逡逑取液及１２个成分同比例混合溶液，进行细胞活性试验。根据本文第二章含量测定结果，逡逑１邋ｍｇ．ｍｌ／１葛根芩连片提取液相应的１２个单体成分葛根素、大豆苷、黄芩苷、大豆苷元、逡逑汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、甘草酸、盐酸黄连碱、表小檗碱、盐酸小檗碱、盐酸巴逡逑马汀浓度分别为邋２９．２６、５．９２、２４．２８、１．７４、４．９０、２．３３、１．０３、２．４２、３．１７、１．９３、１６．５１、逡逑ｌｌＳｆｉｇｍ！／１。结果如表１２所示，ｌｎ＾ｍＬ１葛根芩连片提取液及与之对应的１２个成分逡逑同比例混合溶液组的细胞存活率均大于９０％，因而可选择该浓度溶液开展后续试验。逡逑６６逡逑

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