基于NLRP3炎症小体探讨Aspirin治疗热毒血瘀型内皮损伤机制研究
发布时间：2020-06-14 13:36
【摘要】：目的:内皮细胞功能障碍是心血管疾病发生发展的基础,本研究通过对动物腹腔注射LPS诱导“热毒血瘀”型内皮损伤模型的研究以及给药Aspirin后的病理改变的探讨,从中西医两方面评价Aspirin对“热毒血瘀”型内皮损伤模型的治疗作用。用中医基础理论解释LPS诱导“热毒血瘀”的病因以及Aspirin的治疗机制,并为以后以中医基础理论研究西医西药或指导西医西药治病提供实验依据。方法:(1)临床问卷调查寻找血瘀症生物指标,并通过诱导“热毒血瘀”证动物模型验证相关生物指标:根据早期文献查阅,制作“关于对心血管疾病相关中医证型的临床指标差异性调查问卷”。邀请该领域内的医生和学者进行问卷回答,根据医生及学者的回答,分析统计出符合血瘀型心血管疾病的生物指标。确定好血瘀症的生物指标后,通过“热毒血瘀”型动物模型验证相应指标。腹腔注射LPS诱导“热毒血瘀”型内皮损伤。采用随机分组原则将24只大鼠随机分为3组,即正常组、低剂量模型组以及高剂量模型组,每组8只大鼠。动物实验的1-7天采用腹腔注射方式,分别给予生理盐水、100μg/kg LPS和30μg/kg LPS溶液。观察动物状态、饮食及体重变化。实验进行第8天开始取材。腹腔主动脉取血,血液一部分用来检测血液流变学指标,如全血还原粘度、红细胞积压、红细胞聚集指数、血沉以及纤维蛋白原;另一部分取血清用来检测各种试剂盒,如TG、TC、Apo-A、Apo-B、SOD、LPO、TXB2和6-keto-PGF1α等;取胸主动脉做免疫荧光,检测血管内皮层中VE-Cadherin、ZO1等连接蛋白构成的血管内皮细胞层的完整性。(2)Aspirin治疗LPS诱导“热毒血瘀”型内皮损伤的药效学研究:利用LPS(2μg/mL)刺激小鼠血管内皮细胞造成炎症模型,采用不同浓度的Aspirin干预细胞。将细胞分为正常对照组、LPS 造模组、0.1 mmol/L、0.5mmol/L、1 mmol/L、2mmol/L和3mmol/LAspirin组以及地塞米松阳性药对照组。刺激剂与药物孵育内皮细胞24小时后开始试验。MTT、LDH及细胞增殖实验检测细胞活性,筛选出药物的浓度;免疫荧光检测内皮细胞连接蛋白201/Z02的表达,内皮细胞膜渗透性检测和跨内皮细胞电阻检测一起判断内皮细胞膜的破损情况,检测一氧化氮的释放量以此判断内皮细胞功能的变化。将48只C57BL/6小鼠采用随机分组原则分为正常对照组(Control),模型组(LPS组),阳性药组(Dexamethasone,0.0182mg/kg),低剂量 Aspirin 组(12.5mg/kg),中剂量 Aspirin 组(62.5mg/kg)以及高剂量阿 Aspirin 组(125mg/kg)。LPS 采用 100μg/kg的浓度造模。连续干预7天,第8天处死小鼠并取材。将小鼠的心脏冰冻切片为8μm厚的薄片,冷冻保存。采用免疫荧光共定位的方法检测小鼠心脏微循环血管内皮细胞紧密连接蛋白的完整性:VWF/ZO1,VWF/ZO2。(3)Aspirin治疗LPS诱导“热毒血瘀”型内皮损伤的机制研究:利用LPS(2μg/mL)刺激小鼠血管内皮细胞造成炎症模型,采用不同浓度的Aspirin干预细胞。将细胞分为正常对照组、LPS 造模组、0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2mmol/L Aspirin组。刺激剂与药物孵育内皮细胞24小时后开始试验。细胞内ROS被DCFH-DA探针染上荧光后由细胞实时检测显微镜检测;ROS的释放量,Western Blot检测的TXNIP蛋白的表达量以及免疫荧光共定位TXNIP/NLRP3的结果共同确定NLRP3炎症小体的形成与活化和ROS/TXNIP信号通路有关。Westem Blot检测NLRP3、ASC、Caspase-1、HMGB1和RAGE蛋白的表达以及免疫荧光共定位NLRP3/ASC,NLRP3/Caspase-1,以此判定炎症小体的形成和活化情况。shRNA沉默RAGE以及gRNA沉默NLRP3表达后检测内皮细胞连接蛋白的表达,确定Aspirin改善内皮细胞功能障碍与NLRP3炎症小体活化后所激活的HMGB1-RAGE轴密切相关。运用前期冰冻保存的小鼠心脏冰冻切片,采用免疫荧光共定位的方法检测小鼠切片中心脏微循环血管内皮细胞中NLRP3炎症小体的形成与活化:NLRP3/Caspase-1、VWF/HMGB1。酶联免疫吸附法进一步测定小鼠血清中HMGB1的含量。结果:(1)临床问卷调查寻找生物指标,并通过动物模型验证相关生物指标与动物模型的对应性:对调查问卷进行统计分析,“热毒血瘀”型心血管疾病的生物指标的选择有:血液流变学指标,血脂代谢指标TG、TC,载脂蛋白代谢指标Apo-A、Apo-B,TXA2-PGI2相对平衡指标TBX2和6-keto-PGF1α,氧自由基体系指标SOD和LPO等。实验结果发现,全血还原粘度、红细胞聚集指数和血沉在LPS刺激下明显升高,且呈浓度依赖性增加;红细胞积压变化不明显。检测到的纤维蛋白原的变化也在LPS刺激下呈剂量依赖性的增加。LPS刺激下血清中TG、TC的含量升高,但高剂量LPS的刺激没有低剂量LPS刺激下增长的多;Apo-B/Apo-A的比值随着LPS剂量的增加比值逐步升高。SOD酶的活性在低剂量LPS的刺激下被激活,高剂量的LPS刺激下SOD酶的活性也有所增加,但无统计学意义;LPO在LPS的刺激下含量升高,但无统计学意义。6-keto-PGF1α和TXB2的表达量在LPS刺激下含量增加,6-keto-PGF1α的含量时随LPS剂量的增加而增多,TXB2的表达量在低剂量LPS刺激时最高,高剂量LPS刺激时的含量会比低剂量的含量少;但是TXB2/6-keto-PGF1α的比值却随着LPS剂量的增加而减小。随着给药LPS剂量的增加,内皮层连接蛋白VE-Cadherin、ZO1的完整性遭到破坏,且破坏程度越来越严重,破坏区域越来越多。(2)Aspirin治疗LPS诱导“热毒血瘀”型内皮损伤的药效学研究:对小鼠内皮细胞进行MTT和LDH实验,检测所选LPS浓度、Aspirin浓度以及地塞米松对细胞的低毒性,其中认为3 mmol/L Aspirin对细胞具有毒性。运用细胞实时监测显微镜检测细胞增殖情况,LPS、2mmol/L和3mmol/LAspirin会抑制细胞增殖,3mmol/LAspirin是明显抑制,而其他浓度Aspirin能恢复细胞的增殖,所以认为高浓度Aspirin,即3mmol/L对细胞有毒性,因此将该浓度舍弃。接下来检测内皮功能变化,发现LPS刺激后连接蛋白破损,细胞膜通透性增大,细胞电阻变小,一氧化氮释放量减少,这些说明了内皮细胞功能紊乱;给药Aspirin后情况得到好转,连接蛋白的表达得到修复,细胞膜通透性得到改善,细胞电阻得到回升,一氧化氮释放量明显增多,说明了 Aspirin的有效性,且效果随浓度的增加而越来越明显;但给药地塞米松后,内皮细胞功能紊乱没有得到改善。对小鼠心脏切片进行免疫荧光检测,发现LPS的刺激会导致内皮紧密连接蛋白Z01/Z02的表达量明显降低;地塞米松干预能使紧密连接蛋白得到恢复;低浓度和高浓度Aspirin干预后的Z01/Z02的表达也得到了修复,但中浓度Aspirin对恢复内皮细胞的紧密连接蛋白没有起到恢复作用。(3)Aspirin治疗LPS诱导“热毒血瘀”型内皮损伤的机制研究:细胞实时检测显微镜检测细胞内ROS,LPS刺激会增加细胞内ROS的释放,Aspirin干预可以抑制ROS的释放 Western Blot检测内皮细胞的TXNIP、NLRP3、Caspase-1、HMGB1等蛋白的表达量变化,发现LPS刺激会增加这些蛋白的表达量,而Aspirin干预可以抑制蛋白的表达。但ASC表达量在LPS刺激和Aspirin干预情况下均不变,但用免疫荧光共定位的方法检测TXNIP/NLRP、NLRP3/ASC和NLRP3/Caspase-1的募集情况就会发现,LPS 刺激会增加 TXNIP/NLRP3,NLRP3/ASC,NLRP3/Caspase-1 的共定位区域,而给药Aspirin后共定位区域会减少。运用shRNA技术转染RAGE以及运用gRNA技术转染NLRP3后的内皮细胞用来检测检测内皮连接蛋白,发现无论是LPS刺激还是Aspirin干预,其连接性无明显变化。共染小鼠心脏冰冻切片NLRP3/Caspase-1,发现LPS刺激增加了共定位区域,并且地塞米松、中浓度Aspirin的干预不能减少两种荧光之间的共染,低浓度和高浓度Aspirin均能减少两种荧光间的共定位;共染VWE/HMGB1也得到同样的结果。Elisa试剂盒检测小鼠血清中HMGB1含量,低浓度Aspirin能减少HMGB1在血清中含量,但其余两种浓度的Aspirin无抑制作用,地塞米松却能有效的降低血清中HMGB1的含量。结论:1.LPS成功诱导“热毒血瘀”型内皮损伤模型2.Aspirin可通过恢复内皮细胞连接蛋白功能而起到治疗“热毒血瘀”型内皮损伤的治疗作用3.Aspirin修复内皮细胞连接蛋白的药理作用与NLRP3炎症小体信号通路密切相关
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：
．图１．邋Ａｓｐｉｒｉｎ治疗内皮损伤假设通路图逡逑义逡逑ＬＰＳ诱导“热毒血瘀”型内皮损伤模型逡逑化应激诱导ＮＬＲＰ３炎症小体活化的信号通路机制出发，检测ＡｓｐｉｒｉｎＮＬＲＰ３，Ａｉｒ
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本文编号：2712859
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：
．图１．邋Ａｓｐｉｒｉｎ治疗内皮损伤假设通路图逡逑义逡逑ＬＰＳ诱导“热毒血瘀”型内皮损伤模型逡逑化应激诱导ＮＬＲＰ３炎症小体活化的信号通路机制出发，检测ＡｓｐｉｒｉｎＮＬＲＰ３，Ａｉｒ
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本文编号：2712859
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