【摘要】：环境中常见的致病菌可分为:革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌,这些致病菌严重危害人类健康。随着抗生素的不合理使用,病原菌对药物的耐受性在不断增加。天然抗菌化合物结构和类别复杂多样,一个化合物即可作用多个靶点,菌株对其不易产生耐药性,因此许多研究者把目标转向从植物中寻找高效、天然、具有抗菌活性的化合物。桑枝作为传统中药材,具有较高的药用价值和保健作用,历代很多医药书籍中都有关于其治疗脚气的记载,如著于公元960-1279年宋代的《本草图经》中就有这样的记载:“疗遍体风痒干燥,脚气风气,四肢拘挛”,但其是否具有治疗脚气的效果,效果如何,这值得我们用现代的研究手段来进行研究验证。红色毛癣菌(Trichophyton rubrum,T.rubrum)是脚气的主要致病菌,关于桑枝提取物对红色毛癣菌的抑制活性尚未报道。同时,研究显示,植物在处于逆境(过酸过碱、干旱胁迫、物理刺激、化学刺激、微生物侵害等)时,其自身会合成一些新的化合物或显著提高一些已有化合物的含量,来抵御逆境。故本论文以T.rubrum为初试菌株,对微生物诱导处理后的桑枝提取物进行抑制T.rubrum的活性研究,利用活性贡献度研究方法,在抗菌活性跟踪下,分离、纯化、鉴定出其主要抗菌活性成分—氧化白藜芦醇(oxyresveratrol,OXY),同时研究了OXY对其它3种条件致病菌的抗菌活性,并对其抑菌活性机制进行了探索性研究,同时检测OXY与抗生素联合使用的抑菌效果,为利用桑枝开发抗菌生物制剂提供了理论参考依据。具体研究内容及结果如下:1桑枝提取物抑制T.rubrum的主要活性成分研究实验结果表明,桑枝提取物及其各萃取物对T.rubrum具有一定的抑制作用。其中,乙酸乙酯萃取物(TEE,约占总提物的50%),对红色毛癣菌的抑制活性最强,最小抑菌浓度(MIC)为1.00 mg/mL;其次是石油醚萃取部分(TPE,约占总提取物的2%)和桑枝总提取物(TAE),当其浓度为1.00 mg/mL时,其抑制率分别为84.31%和83.01%;最后是正丁醇萃取部分(TNE,约占总提取物的20%)和剩余水部分(TWE,约占总提取物的30%),当其浓度为1.00 mg/mL时,其抑制率分别为50.98%和44.44%。在抑制T.rubrum活性跟踪下,通过活性贡献度研究方法,利用各种分离纯化及鉴定手段,从TEE中纯化出一个主要活性单体化合物—OXY。经研究,OXY对T.rubrum的抑制活性较好,其MIC值为0.50 mg/mL,IC_(50)为0.065 mg/mL,其在TEE抑制T.rubrum活性中的贡献度约为80.52%,在TEE抑制T.rubrum活性中起到了主要作用,是桑枝中主要的抗菌活性物质之一。协同抑菌试验表明OXY与硝酸益康唑(MN)联合使用对T.rubrum的MIC值均降低为原来的1/2 MIC。通过两种药物组合的FICI指数,得出OXY与MN联合使用对T.rubrum的抑制作用具有叠加效应。2 OXY对大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)的抗菌活性微量肉汤稀释法研究显示OXY能改变菌株的生长速度,延长了菌株的对数期与稳定期,且对3种菌株具有杀伤作用,其对E.coli、S.aureus、C.albicans的MIC值分别为1.00 mg/mL、0.50 mg/mL、1.00 mg/mL;最小杀菌浓度(MBC)分别为4.00 mg/mL、0.50 mg/mL、4.00 mg/mL。同时,OXY与抗生素的协同效应研究中,其与庆大霉素(GS)联合使用对E.coli的MIC_(联合)值为各自的1/2 MIC值,MBC_(联合)1/2 MIC_(各自),对S.aureus的MIC_(联合)值为各自的1/4 MIC,MBC_(联合)=1/2 MIC;OXY与MN联合使用对C.albicans的MIC_(联合)值为各自的1/4 MIC,MBC_(联合)1/2 MIC_(联合)。通过两种药物组合的FICI指数,得出OXY与GS联合使用对E.coli的抑制作用具有叠加效应,对S.aureus的抑制作用具有协同效应;OXY与MN联合使用对C.albicans的抑制作用具有协同效应。3 OXY抗菌机制研究透射电镜观察发现,OXY能够改变菌株的细胞形态,导致胞质着色变浅,出现空洞,同时还导致E.coli和C.albicans的质壁分离,并破坏了S.aureus和C.albicans的细胞壁;细胞膜完整性检测发现,OXY虽然未对3种菌株的细胞膜产生明显的破坏作用,但改变了其构象;同时OXY抑制了3种菌株生物膜的形成,从而影响了菌株的生长与繁殖。该研究为利用桑枝开发天然抗菌生物制剂提供了理论参考依据,具有重要的现实意义。OXY作为一种安全的天然产物,可作为一种抗菌添加剂,广泛应用于护肤品或保健品中;同时OXY也可以和抗生素联合使用来辅助治疗一些由细菌或真菌感染所引起的疾病,从而降低抗生素的使用量。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：
图 3-3 化合物 TLC 图-3 The TLC picture of液溶解，进行质谱(M + 1］+，同时，FAB-的分子质量为 244.03 3-4 化合物 MS 检测
图 3-3 化合物 TLC 图Fig. 3-3 The TLC picture of compound将重结晶单体化合物用DMSO溶液溶解，进行质谱(MS)鉴定，结果如图3-4所示，FAB+-MSm/z 给出了准分子离子峰 245.05［M + 1］+，同时，FAB--MS m/z 给出了准分子离子峰 243.05［M + 1］-；因此，可确定此化合物的分子质量为 244.03，这与 OXY 的相同。图 3-4 化合物 MS 检测图Fig. 3-4 The MS picture of compound其磁共振数据:1H-NMR ( 400 MHz，DMSO) δ: 7. 35 ( 1H，d，J = 8.5Hz
【参考文献】
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