基于识别Fn14的姜黄素脂质体靶向抗肝纤维化的初步研究

发布时间：2020-06-15 07:36

【摘要】：背景肝纤维化是由长期肝损伤引起,导致细胞外基质过度沉积的机体创伤修复反应。肝星状细胞在肝纤维化的进程中扮演了重要角色,而抑制其增殖活化过程则成为肝纤维化治疗的有效策略。全球范围来看,肝纤维化和肝硬化的发病率和死亡率一直居高不下,但目前临床却没有切实有效的肝纤维化治疗药物或手段,对患者及医生造成了极大的困扰。因此我们亟需研发安全有效、具有针对性的抗纤维化制剂,解决临床用药难、病人病情无法得到有效控制的问题。目的本课题组前期通过镜像mRNA展示技术获得了具有肝星状细胞靶向能力的功能多肽(序列:~DC~DH~DP~DR~DE~DV~DD~DV~DE~DL~DY~DS~DT~DV~DF~DG~DH,Fn14-binding peptide,简称D-FNB)。课题研究目的在于,开发安全有效并能靶向到达病灶部位的抗纤维化制剂,采用主动靶向递药策略治疗肝纤维化,其主要内容包括多肽导向分子修饰靶向脂质体的制备与表征、多肽导向分子修饰靶向脂质体体外靶向性及药效评价以及多肽导向分子修饰靶向脂质体体内靶向性及药效评价三个方面,具体实验及结果如下:方法与结果多肽导向分子修饰靶向脂质体的制备与表征。首先使用SPR和分子对接技术考察功能多肽与Fn14胞外区蛋白的结合能力和键合方式,实验结果表明功能多肽(序列为~DC~DH~DP~DR~DE~DV~DD~DV~DE~DL~DY~DS~DT~DV~DF~DG~DH)对Fn14胞外区蛋白有较强的亲和力。利用MAL-PEG3400-DSPE中活化基团马来酰亚胺与D-FNB肽的活性巯基反应,合成得到靶向材料D-FNB-PEG3400-DSPE,采用薄层色谱法(TLC)监测反应进程,然后对水透析纯化冻干。结果表明该法能够成功合成脂质体靶向材料D-FNB-PEG3400-DSPE。其后将传统多酚类抗炎药物姜黄素(CUR)作为药物模型,采用薄膜水化法制备D-FNB-LIP/CUR,所得脂质体粒径较均一(144.21±1.14 nm),分散性良好,透射电镜(TEM)下脂质体形态圆整,脂质体包封率高达94.86±2.14%,体外释放结果表明,脂质体上是否修饰D-FNB肽对CUR的释放情况没有影响。多肽导向分子修饰靶向脂质体体外靶向性及药效评价。首先使用细胞免疫荧光定性考察两种细胞上的受体表达情况。结果表明,活化型肝星状细胞上高表达α-SMA和Fn14受体,而正常肝细胞则低表达或不表达α-SMA和Fn14受体。说明活化型肝星状细胞上特异性高表达Fn14受体。而后采用倒置荧光显微镜和流式细胞仪对D-FNB-LIP的体外细胞摄取进行定性及定量评价,荧光显微镜观察显示,D-FNB-LIP/Coumarin-6在肝星状细胞上的荧光量明显强于mPEG-LIP/Coumarin-6,但在正常肝细胞上的荧光摄取差别不大。同时经流式定量摄取表明,D-FNB-LIP/Coumarin-6相较于mPEG-LIP/Coumarin-6在肝星状细胞的荧光摄取量上提高了2.54倍,而在正常肝细胞上无明显差异。其次,通过靶向脂质体竞争性抑制实验再次证实D-FNB肽能够特异性识别Fn14过表达细胞。综上实验表明,D-FNB-LIP具有良好的体外靶向性。其后通过细胞药效MTT实验,评价D-FNB肽修饰脂质体的体外细胞毒性,结果表明D-FNB-LIP/CUR(IC50=7.3μg/m L)相较于mPEG-LIP/CUR(IC50=18.6μg/m L)细胞毒性更强,能够有效抑制肝星状细胞的增殖,而对正常肝细胞无明显毒性。最后通过TUNEL细胞凋亡检测和Western Blot探究姜黄素制剂对活化型肝星状细胞的作用机制。细胞凋亡检测结果表明,D-FNB-LIP/CUR能够诱导更多活化型肝星状细胞启动凋亡程序,进入凋亡状态。同时Western Blot结果显示D-FNB-LIP/CUR可在一定程度上较多抑制活化型肝星状细胞上α-SMA的表达。初步显示姜黄素制剂在体外可通过导致细胞凋亡和抑制α-SMA表达、减少细胞外基质的合成分泌的方式发挥抗纤维化药效,以达到缓解肝纤维化的作用。多肽导向分子修饰靶向脂质体体内靶向性及药效评价。首先使用腹腔注射四氯化碳的方法建立小鼠肝纤维化模型,并采用肝功生化指标、外观和HE、天狼猩红染色评价不同周期造模小鼠的纤维化程度。其中血清生化指标测定结果显示,造模八周小鼠的AST、ALT指标远高于正常小鼠,提示肝功能异常。另外通过解剖造模小鼠肝脏发现,正常组肝脏质地柔软、表面光滑、富有光泽,而模型组肝脏质地变硬、没有光泽、颗粒感严重,说明肝脏部位发生病变。而后HE染色结果显示,造模八周小鼠的炎性细胞浸润,肝小叶结构紊乱,中央静脉桥接坏死并形成假小叶。天狼猩红染色则将大量沉积于纤维隔膜和汇管区的胶原染成红色,表现为红色网状纤维。综上实验表明成功建立肝纤维化动物模型。体内实验则首先使用荧光成像和体内组织分布评价D-FNB-LIP/DiR的体内靶向性,荧光成像实验证明,D-FNB-LIP/DiR相较于mPEG-LIP/DiR能显著提高制剂在造模小鼠肝脏的分布,而在正常小鼠体内分布区别相对较少,同时体内组织分布结果表明,D-FNB-LIP/CUR相较于mPEG-LIP/CUR在造模小鼠肝脏分布更多,综上提示其在造模小鼠体内靶向性较好。其次通过组织制剂共定位实验考察了D-FNB肽修饰脂质体的体内分布,实验结果表明D-FNB-LIP/Coumarin-6肝纤维化发生部位的聚集相较于mPEG-LIP/Coumarin-6更为密集,进一步揭示了D-FNB-LIP/Coumarin-6能够有针对性的将药物递送到病灶部位。此后将肝纤维化小鼠分为D-FNB-LIP/CUR组、mPEG-LIP/CUR组和生理盐水组,利用组织免疫荧光、HE染色、天狼猩红染色并测定肝功生化指标、对各组药效进行评判。肝脏免疫荧光结果显示,FNB-LIP/CUR治疗组切片的α-SMA、Fn14表达量相较于mPEG-LIP/CUR组和生理盐水组明显降低。切片染色结果表明D-FNB-LIP/CUR组的肝纤维化部位相较于另外两组恢复较好,且AST、ALT指标有所降低,指示炎症减轻。而mPEG-LIP/CUR组和生理盐水组AST、ALT水平依旧很高,炎症严重。以上结果表明D-FNB-LIP/CUR相较于而mPEG-LIP/CUR和生理盐水组可明显缓解肝脏纤维化程度,对肝纤维化具有一定的治疗效果。结论综上所述,本研究设计并制备了导向分子(D-FNB肽)介导的靶向递药系统,借助主动靶向递药策略,有效提高了药物在病灶部位的蓄积,并通过体内外药效学研究,证实该靶向制剂所具有的治疗效果。以达到抑制活化型肝星状细胞的增殖,减轻炎症从而减少细胞外基质沉积,改善肝纤维化的目的,本课题成功制备多肽导向分子修饰的包载姜黄素药物的主动靶向递药系统,为肝纤维化的研究治疗提供了有益的思路。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R283.6;R285
【图文】：

键合图,受体,键合,多肽

其检测原理为分子间相互作用力越强，则芯片表面折射率变化值越大。由（图1-1A）所示，D-FNB 肽对 Fn14 受体胞外区蛋白有明显结合，且信号强度与多肽浓度呈正相关，而通入缓冲液时则未引起上述含肽缓冲液产生的信号变化，说明缓冲液对芯片信号影响不大。初步说明，D-FNB 肽能够特异性结合 Fn14 受体胞外区蛋白，可作为潜在的 Fn14 蛋白导向分子用于后续研究。利用分子对接模拟 D-FNB 肽与 Fn14 受体胞外区蛋白的键合方式如（图1-1B）所示为，蓝色部分为 D-FNB 肽，灰色丝带代表 Fn14 受体胞外区蛋白，黑色虚线则代表氢键，结果显示，多肽上 His1 和 Arg3 的 N-末端氨基与 Fn14 胞外区蛋白（Fn14ECD）中的 Asp45 和 Asp62 产生静电作用，且多肽上的 Glu4 也因静电相互作用而与 Fn14ECD上 Arg58 相结合。多肽尾部肽的 Phe14 在与 Fn14ECD上的Arg56 形成阳离子-π 键相互作用。Val5

生物质谱,薄层色谱法,情况

第一章多肽导向分子修饰的靶向脂质体制备及表征D-FNB 上的巯基反应生成硫醚键而合成的。该反应条件温和，活性较高且易于键合。反应所用 D-FNB 肽略过量于 MAL-PEG3400-DSPE，通过 TLC 和 MALDI-TOF监测表明已反应完全。实验结果（图 1-2A）显示，功能多肽 D-FNB（a），MAL-PEG3400-DSPE（b），反应物（c）中因存在溶剂 DMF（d）而出现溶剂条带，但反应物在不同位置出现了褐色条带，说明反应混合物中已生成目标产物 D-FNB-PEG3400-DSPE。实验结果（图 1-2B）所示 D-FNB-PEG3400-DSPE 和 MAL-PEG3400-DSPE 的MALDI-TOF 图谱，图中分别为 MAL-PEG3400-DSPE 和 D-FNB-PEG3400-DSPE 的质谱峰。图中 MAL-PEG3400-DSPE 分子量为 4200 Da，D-FNB-PEG3400-DSPE 的分子量为 6200 Da，聚合反应前后的分子量相差大约 2000 Da，与 D-FNB 肽分子量的理论值（1988 Da）相似，分析表明该靶向材料合成成功。

【参考文献】