基于Label free和高通量测序技术研究炮制对水蛭蛋白及表面真菌的影响

发布时间：2020-06-15 14:48

【摘要】：1研究目的1.1研究水蛭生品、滑石粉烫制品、酒炙品抗凝血活性差异,为水蛭的临床应用提供参考依据。1.2研究炮制对水蛭蛋白的影响,采用统计学方法分析主要的差异蛋白,为水蛭生品及其炮制品的药效物质研究提供参考依据。1.3研究炮制对水蛭表面真菌的影响,找出水蛭生品及其炮制品表面的优势菌群,为水蛭的质量控制提供参考依据。2研究内容与研究方法2.1样品收集在河北安国药材市场收集清水吊干水蛭药材10批,密封,4℃保存备用。2.2水蛭炮制按照2015版《中国药典》通则(0213)规定对水蛭药材进行酒炙和滑石粉烫制。2.3水蛭及其炮制品抗凝血活性检测按照2015版《中国药典》水蛭含量测定项下规定的滴定法及活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)对水蛭生品及其炮制品的抗凝血活性进行评价。2.4水蛭生品及其炮制品蛋白质检测2.4.1SDS-PAGE法初步探究水蛭生品及其炮制品的蛋白差异利用SDS-PAGE凝胶电泳技术对水蛭生品及其炮制品的蛋白差异进行初步分析。2.4.2Label free法蛋白组学分析使用蛋白裂解液对蛋白进行提取,通过BCA法对提取的蛋白进行定量分析,对质量达标的蛋白进行还原烷基化处理,随后进行Trypsin酶解,对Trypsin酶解得到的肽段进行液相串联质谱分析。依据Label free技术将质谱采集到的数据在水蛭蛋白数据库中进行搜索和匹配。分析水蛭生品及其炮制品的蛋白差异。2.5水蛭生品及其炮制品饮片表面真菌的培养与鉴定用无菌水冲洗水蛭生品及其炮制品饮片表面的真菌,采用平板法培养真菌。将得到的真菌进行分离、纯化。结合真菌菌落形态、显微结构、DNA条形码技术共同鉴定水蛭饮片表面真菌种类。统计水蛭生品及其炮制品药材表面真菌数目及种类,找出主要污染菌。2.6基于Illumina HiSeq 2500测序平台分析水蛭表面真菌多样性对水蛭生品及其炮制品表面真菌DNA进行提取,以ITS1序列为引物,进行PCR扩增。对PCR产物进行纯化,质检合格的样品用Illumina HiSeq 2500进行测序。测序得到的原始序列,经过碱基识别,形成原始的测序序列,得到双端Reads(PE reads),拼接双端reads得到原始序列数(Raw Tags),原始序列过滤、去除嵌合体后得到有效序列数(Effective Tags)。使用质控过后的有效序列(Effective Tags)划分操作分类单元,进行物种注释。获得各样品在界、门、纲、目、科、属、种分类学水平上的群落结构组成,分析水蛭饮片表面真菌种类的多样性。3研究结果3.1水蛭抗凝血活性检测通过2015版《中国药典》规定的滴定法检测发现水蛭生品及其炮制品抗凝血活性满足药典规定的3.0U。水蛭生品与炮制品对活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)有显著的延长作用,对凝血酶原(PT)时间影响较小。结合滴定法和体外检测结果发现水蛭生品抗凝血活性最好,酒炙品次之,滑石粉烫制品的抗凝血活性最弱。3.2水蛭生品及其炮制品蛋白差异分析SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,蛋白裂解液提取的蛋白条带个数最多且较为清晰。水蛭生品与炮制品在蛋白质的条带颜色和数量上均存在较为明显的差异,生品较为清晰的条带个数约有11条,颜色较深。酒炙品较为清晰的条带约有7个,颜色较浅。滑石粉烫制品较为清晰的条带个数约有5-7个。表明水蛭在炮制过程中蛋白发生了降解。水蛭酒炙品与水蛭生品搜库得到的蛋白质相比较,差异蛋白质中增加的为6个,下降的为72个。水蛭滑石粉烫制品与水蛭生品搜库得到的蛋白质相比较,差异蛋白质中增加的为6个,下降的为192个。表明生品与酒炙品的蛋白表达更为接近。3.3水蛭生品及其炮制品表面真菌污染情况及多样性分析对水蛭生品表面真菌进行培养共得到12种真菌,数量无法计数。对水蛭酒炙品表面真菌进行培养共得到15种,154株真菌。对水蛭滑石粉烫制品表面真菌进行培养共得到18种,107株真菌。水蛭表面真菌以曲霉属、青霉属、链格孢属、枝孢属为主。高通量测序结果显示,水蛭表面真菌多样性酒炙品滑石粉烫制品生品。真菌种类与平板法结果相似。4结论4.1综合滴定法以及体外抗凝血活性研究发现水蛭抗凝血活性水蛭生品优于炮制品,酒制品的抗凝血活性略高于滑石粉烫制品。4.2综合SDS-PAGE与Label free结果,水蛭生品经过炮制后蛋白含量减少,但是炮制品仍有抗凝血活性,表明水蛭生品炮制过中大分子蛋白质变成具有抗凝血活性的小分子蛋白或肽段。4.3综合平板法及高通量测序结果,水蛭炮制品表面真菌种类多于生品,水蛭表面真菌主要来自青霉属和曲霉属。5创新点5.1首次利用Label free技术对水蛭生品及其炮制品的蛋白组学进行研究,从蛋白层面分析水蛭生品与炮制品的药效差异。5.2首次利用Illumina Hiseq平台对水蛭生品及其炮制品表面真菌进行高通量测序,并对其表面多样性进行评估。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R283
【图文】：

图１实验流程图逡逑

图２－１水蛭生品及其炮制品抗凝血酶效价柱状图逡逑水蛭生品及其炮制品的凝血酶滴定结果显示，水蛭生品、酒炙品、滑石粉烫制血活性的均值分别为４．６７邋Ｕ、３．５４邋Ｕ、３．２９邋Ｕ，符合药典规定。生品的抗凝血活于酒炙品和滑石粉烫制品。利用ＳＡＳ软件对方差进行分析，结果显示水蛭生品、逡逑

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本文编号：2714571