【摘要】：目的:本研究应用脂多糖诱导人正常结肠上皮细胞构建溃疡性结肠炎细胞模型,模型建立成功后使用靛玉红干预细胞模型,通过酶联免疫吸附试验检测促炎细胞因子和抑炎细胞因子表达含量的变化,明确靛玉红的抗炎作用,并通过蛋白免疫印迹法、实时荧光定量PCR探索靛玉红改善炎症反应的作用机制与靶点。材料与方法:培养人正常结肠上皮细胞(HCoEpiC),使用脂多糖(LPS)刺激HCoEpiC使其产生炎症反应并根据炎症因子IL-6释放量确定LPS的最佳使用浓度从而明确模型建立的最优条件,建立模型后使用不同浓度靛玉红溶液对其进行干预,分析细胞存活率以确定靛玉红最佳用药浓度,同时使用不同浓度靛玉红溶液干预正常HCoEpiC,观察靛玉红对细胞存活率的影响,确定其安全浓度,根据上述实验获得条件将细胞随机分为6组:正常组、模型组、靛玉红组高、中、低剂量组和靛玉红联合组(靛玉红+PPM-18),除正常组外均使用LPS刺激HCoEpiC细胞构建UC模型细胞,治疗组加入相应浓度靛玉红进行干预,培养24小时后取材,使用酶联免疫吸附试验测试靛玉红对各组细胞上清液中促炎细胞因子(TNF-α、IL-12)和抑炎细胞因子(IL-4)释放量的影响,使用实时荧光定量PCR检测靛玉红对NF-κB的mRNA表达的影响,使用蛋白免疫印迹法检测靛玉红对各组细胞PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB蛋白表达量的影响。结果:1.不同培养时间下HCoEpiC的生长情况将12H,24H,48H三组数据OD均值进行比较24H48H12H,与12H组进行比较,24H组OD均值显著升高(P0.01),与12H组进行比较,48H组OD均值升高(P0.05),与24H组进行比较,48H组OD均值降低且无统计学意义(P0.05)。2.不同浓度LPS对HCoEpiC的IL-6表达影响与正常组进行对比,其余各组IL-6浓度均显著增高(P0.01)。与5?g/ml组进行对比,10?g/ml组、15?g/ml组IL-6浓度显著升高(P0.01)。与10?g/ml组进行对比,15?g/ml组IL-6浓度显著升高(P0.01)。3.不同浓度靛玉红对HCoEpiC存活率的影响与正常组进行对比,LPS组和1μmol/L组细胞存活率显著下降(P0.01),0.5μmol/L组、0.25μmol/L组、0.125μmol/L组与正常组比较无统计学差异(P0.05)。与LPS组进行对比,1μmol/L组细胞存活率上升(P0.05),0.5μmol/L组、0.25μmol/L组、0.125μmol/L组细胞存活率显著上升(P0.01)。与1μmol/L组进行对比,0.5μmol/L组细胞存活率上升(P0.05),0.25μmol/L组和0.125μmol/L组细胞存活率显著上升(P0.01)。0.5μmol/L组、0.25μmol/L组、0.125μmol/L组三组细胞存活率进行对比无统计学差异(P0.05)。4.不同浓度靛玉红对LPS诱导HCoEpiC存活率的影响与正常组比较,其余各组细胞存活率均明显下降(P0.01)。与LPS组比较,25μmol/L、5μmol/L组无统计学差异(P0.05),1μmol/L组、0.5μmol/L组、0.25μmol/L组、0.125μmol/L组细胞生存率显著上升(P0.01)。与25μmol/L组进行比较,5μmol/L组和1μmol/L组无统计学差异(P0.05),0.5μmol/L组和0.25μmol/L组细胞存活率显著上升(P0.01),0.125μmol/L组细胞存活率上升(P0.05)。与5μmol/L组进行比较,1μmol/L组和0.25μmol/L组细胞存活率上升(P0.05),0.5μmol/L组和0.25μmol/L组细胞存活率显著上升(P0.01)。1μmol/L组、0.5μmol/L组、0.25μmol/L组和0.125μmol/L组进行组间比较无统计学差异(P0.05)。5.靛玉红对LPS诱导的HCoEpiC促炎因子TNF-α表达的影响与正常组进行对比,模型组、靛玉红高、中、低剂量组及联合组TNF-α表达量显著升高(P0.01)。与模型组进行比较,靛玉红高、中、低剂量组及联合组TNF-α表达量显著降低(P0.01)。靛玉红高、中、低剂量组三组进行组间比较,TNF-α表达量差异显著(P0.01),且靛玉红中剂量组TNF-α表达量最低。靛玉红中剂量组与靛玉红联合组比较无统计学差异(P0.05)。与靛玉红低剂量组进行对比,靛玉红中剂量组、靛玉红联合组TNF-α表达量均显著降低(P0.01)。6.靛玉红对LPS诱导的HCoEpiC促炎因子IL-12表达的影响与正常组进行对比,模型组、靛玉红高、中、低剂量组及联合组IL-12表达量均显著升高(P0.01)。与模型组进行对比,靛玉红高、中、低剂量组及联合组IL-12表达量显著降低(P0.01)。与靛玉红高剂量组进行对比,靛玉红中剂量组IL-12表达量降低(P0.05),靛玉红低剂量组和靛玉红联合组IL-12表达量显著上升(P0.01)。与靛玉红中剂量组进行对比,靛玉红低剂量组IL-12表达量显著上升(P0.01),靛玉红联合组IL-12表达量显著降低(P0.01)。与靛玉红低剂量组进行对比,靛玉红联合组IL-12表达量显著降低(P0.01)。7.靛玉红对LPS诱导的HCoEpiC抗炎因子IL-4表达的影响与正常组进行对比,模型组、靛玉红高、中、低剂量组及联合组IL-4表达量显著降低(P0.01)。与模型组进行对比,靛玉红高、中、低剂量组及联合组IL-4表达量显著上升(P0.01)。靛玉红高剂量组与靛玉红中剂量组进行对比无统计学差异(P0.05),与靛玉红高剂量组进行对比,靛玉红低剂量组和靛玉红联合组IL-4表达量显著降低(P0.01)。与靛玉红中剂量组进行对比,靛玉红低剂量组IL-4表达量显著降低(P0.01)。与靛玉红联合组进行对比,靛玉红中剂量组和靛玉红低剂量组均无统计学差异(P0.05)。8.靛玉红对LPS诱导的HCoEpiC NF-κB蛋白表达量影响与正常组进行对比,模型组、靛玉红高、中、低剂量组NF-κB蛋白表达量显著升高(P0.01),靛玉红联合组NF-κB蛋白表达量升高(P0.05)。与模型组进行对比,靛玉红高、中剂量组及联合组NF-κB蛋白表达量显著降低(P0.01),靛玉红低剂量组与模型组比较无统计学差异(P0.05)。与靛玉红高剂量组进行对比,靛玉红低剂量组NF-κB蛋白表达量升高(P0.05),靛玉红联合组NF-κB蛋白表达量显著降低(P0.01),靛玉红中剂量组与靛玉红高剂量组进行对比无统计学差异(P0.05)。与靛玉红高剂量组进行对比,靛玉红联合组NF-κB蛋白表达量降低(P0.05)。与靛玉红低剂量组进行对比,靛玉红高剂量组、靛玉红联合组NF-κB蛋白表达量显著降低(P0.01)。9.靛玉红对LPS诱导的HCoEpiC NF-κB的mRNA表达影响与正常组进行对比,模型组、靛玉红高、中、低剂量组NF-κB mRNA表达量显著升高(P0.01),靛玉红联合组NF-κB mRNA表达量升高(P0.05)。与模型组进行对比,靛玉红高、中、低剂量组及联合组NF-κB mRNA表达量显著降低(P0.01)。与靛玉红高剂量组进行对比,靛玉红低剂量组NF-κB mRNA表达量显著升高(P0.01)。靛玉红中剂量组、靛玉红高剂量组、靛玉红联合组三组之间无统计学差异(P0.05)。与靛玉红低剂量组进行对比,靛玉红高剂量组、靛玉红联合组NF-κB mRNA表达量显著降低(P0.01)。10.靛玉红对LPS诱导的HCoEpiC PI3K蛋白表达量的影响与正常组进行对比,模型组、靛玉红高、中、低剂量组以及靛玉红联合组PI3K蛋白表达量显著升高(P0.01)。与模型组进行对比,靛玉红高、中剂量组及联合组PI3K蛋白表达量显著降低(P0.01),靛玉红低剂量组与模型组比较无统计学差异(P0.05)。与靛玉红高剂量组进行对比,靛玉红低剂量组PI3K蛋白表达量显著升高(P0.01),与靛玉红高剂量组进行对,靛玉红中剂量组和靛玉红联合组均无统计学差异(P0.05)。与靛玉红中剂量组进行对比,靛玉低剂量组PI3K蛋白表达量显著上升(P0.01),靛玉红中剂量组与靛玉红联合组比较无统计学差异(P0.05)。与靛玉红低剂量组进行对比,靛玉红联合组PI3K蛋白表达量显著降低(P0.01)。11.靛玉红对LPS诱导的HCoEpiC AKT蛋白表达量的影响正常组、模型组、靛玉红高、中、低剂量组及靛玉红联合组组间比较均无统计学差异(P0.05)。12.靛玉红对LPS诱导的HCoEpiC p-AKT蛋白表达量的影响与正常组进行对比,模型组、靛玉红高、中、低剂量组p-AKT蛋白表达量显著升高(P0.01),靛玉红联合组与正常组进行比较p-AKT蛋白表达量升高(P0.05)。与模型组进行对比,靛玉红高、中剂量组及联合组p-AKT蛋白表达量显著降低(P0.01),靛玉红低剂量组与模型组比较p-AKT蛋白表达量降低(P0.05)。与靛玉红高剂量组进行对比,靛玉红低剂量组p-AKT蛋白表达量显著升高(P0.01),靛玉红联合组p-AKT蛋白表达量显著降低(P0.01),与靛玉红高剂量组与靛玉红中剂量组无统计学差异(P0.05)。与靛玉红中剂量组进行对比,靛玉低剂量组P-AKT蛋白表达量显著上升(P0.01),靛玉红联合组p-AKT蛋白表达量显著降低(P0.01)。与靛玉红低剂量组进行对比,靛玉红联合组P-AKT蛋白表达量显著降低(P0.01)。结论:1.使用LPS诱导HCoEpiC建立UC模型细胞通过使用LPS诱导HCoEpiC能够使该细胞发生炎症反应并释放促炎细胞因子,从而模拟人体结肠组织发生炎症反应。2.靛玉红的安全性及疗效适当浓度的靛玉红对细胞活性影响极小,且该浓度靛玉红也能降低促炎细胞因子的释放以减轻炎症反映,故靛玉红对UC治疗效果良好且安全可靠。3.靛玉红能够影响多种细胞因子的释放靛玉红能够在降低促炎细胞因子TNF-α、IL-12和IL-6表达量的同时增加抑炎细胞因子IL-4的表达量,从抗炎和免疫调节等多方面对UC进行治疗。在本实验中联合组IL-12释放量并没有因为NF-κB信号通路活性降低而进一步减少,提示IL-12释放量可能与其它信号通路相关性更强。4.靛玉红能够抑制NF-κB信号通路活性本实验结果表明靛玉红具有良好的抗炎作用,与模型组比较各治疗组均能有效抑制NF-κB信号通路活性,而NF-κB信号通路激活其下游一系列促炎细胞因子的产生会导致UC的病情恶化,因此靛玉红可以通过抑制其活性减少炎症因子的分泌达到对UC的治疗作用。5.靛玉红能够抑制PI3K/AKT信号通路活性本实验结果表明与模型组比较各治疗组均能有效抑制PI3K/AKT信号通路活性,起到抑制PI3K表达和阻断AKT磷酸化的作用,因此靛玉红能够抑制PI3K/AKT信号通路活性从而控制UC的发展且降低其癌变几率。6.靛玉红可作用于多个治疗靶点靛玉红能够抑制PI3K/AKT以及NF-κB信号通路活性,PI3K/AKT信号通路的激活能够上调NF-κB信号通路的活性,NF-κB信号通路活性降低可使其下游促炎细胞因子释放量降低,防止因PI3K/AKT信号通路活性增强从而产生的正反馈调节,同时靛玉红也能影响多种炎症因子的释放。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：
均值升高（P＜0.05），与 24H 组进行比较，48H 组 OD 均值降低但两组之间无统计学意义（P＞0.05）。图1 不同培养时间OD值比较2. 不同浓度LPS对HCoEpiC细胞 IL-6表达水平的影响去空白，计算IL-6浓度后将不同组别结果进行对比，与正常组进行对比，5 g/ml组、10 g/ml组与15 g/ml组IL-6浓度显著升高（P＜0.01）。与5 g/ml组进行对比，10 g/ml与15 g/ml组IL-6浓度显著升高（P＜0.01）。与10 g/ml组进行对比，15 g/ml组IL-6浓度显著升高（P＜0.01）。
不同浓度靛玉红对细胞生存率的影响
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本文编号：2716714
