甘草对D-gal诱导的大鼠抗衰老作用及基于牛磺酸通路的靶标代谢组学研究

发布时间：2020-06-17 10:33

【摘要】：选题依据:随着人口老龄化趋势的逐渐加剧,如何安全有效地提高老年人的生活质量,优化其健康和社会医疗保障等过程,甚至延缓衰老已经变得尤为重要,并逐渐成为人们关注的焦点。衰老是一种机体组织或器官退行性变化的不可避免的自然规律,它能够影响老年人群的生活质量,降低其免疫力进而损害其健康,甚至威胁到老年人的生命。因此,如何安全有效的延缓衰老也变得日益迫切。但是近年来在衰老及抗衰老相关研究中并没有取得较大的进展,目前仍未发现安全、有效的抗衰老药物。然而,随着中药现代化研究的不断推进与发展,药食同源类中药在衰老研究中得到了广泛的关注。甘草作为一种药食两用植物,已经广泛的应用于医疗保健和各类食品中。甘草作为一种传统的补益中草药,具有补脾益气、润肺止咳等多种药理作用和生物学功能。现代研究表明甘草具有抗炎、抗病毒、抗氧化、增强机体免疫力等药理作用,甘草主要活性成分甘草酸、甘草素、甘草苷等具有抗氧化、神经保护和改善认知功能等作用。研究者认为抗氧化作用有助于延缓衰老,许多研究结果也表明补充抗氧化剂可以减轻年龄相关的认知障碍,延缓衰老过程。虽然大量的证据表明甘草具有显著的抗氧化作用,但鲜有研究探究甘草在衰老相关模型中的抗衰老作用。基于以上理论基础,我们推测甘草具有抗衰老作用。研究表明D-半乳糖诱导的亚急性大鼠衰老模型和自然衰老的大鼠具有较多的相似特征,特别是氧化应激损伤和学习记忆功能障碍。当长期给予D-半乳糖溶液后,使得机体产生大量的自由基,进而诱导机体处于过氧化状态,进一步导致神经功能障碍和学习记忆能力的降低。此外,高浓度的D-gal溶液在机体会被氧化成醛糖和过氧化氢,进一步形成氧自由基、超氧阴离子,可以与蛋白质和多肽在无酶参与的作用下形成稳定的共价加成化合物晚期糖基化终末产物(AGEs),使蛋白质和多肽的空间结构发生变化,从而导致其生理活性和生理功能发生变化,促进大鼠产生神经元凋亡和神经退行性病变。因此,长时间给予大鼠D-gal溶液能够使其产生类自然衰老特征。代谢组学作为一种新的系统生物学技术,已经广泛的应用于研究机体受到外界因素干扰时内源性代谢物水平的变化,是研究小分子代谢物在体内代谢过程中动态变化的一种新方法,是生物体系整体功能或状态的最终结果表现。并借助多元统计分析进一步分析内源性代谢物的变化,进而探究药物或者其他外源性因素干扰机体的生理、病理变化机制。目的:本研究基于D-gal致大鼠衰老模型对甘草水提物的抗衰老药效进行评价,并采用代谢组学技术对其抗衰老作用机制进行探究。方法:(1)实验大鼠分组、衰老模型建立和给药:以SPF级雄性SD大鼠为研究对象,采用D-半乳糖溶液复制衰老大鼠模型;实验分为5组,即对照组、模型组和甘草水提物低、中、高剂量(1、5、10 g/kg)组;模型的建立采用连续腹腔注射给予D-半乳糖溶液(300 mg/kg)5周,对照组腹腔注射相应剂量的生理盐水,各给药组则在造模同时灌胃给予相应剂量的甘草水提物。(2)药效学评价:通过Morris水迷宫实验和新物体识别实验评价衰老大鼠的学习记忆能力。行为学结束后,采用4%水合氯醛将大鼠麻醉并处死,收集血清和组织样本。采用苏木精-伊红染色(HE染色)观察其海马组织和肝组织的损伤程度。采用试剂盒测定海马组织和肝组织的丙二醛(MDA)水平,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,并测定海马组织中的乙酰胆碱酯酶(AChE)活性和乙酰胆碱(ACh)水平变化。采用Western blot实验测定海马组织中凋亡相关蛋白Cyt-c、Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达水平。(3)代谢组学分析:行为学结束后,收集其12h尿液;然后采用4%水合氯醛麻醉大鼠,经股动脉取血并收集组织样本。然后采用代谢组学技术对肝脏组织、血清、尿液进行代谢组学分析。首先采用无监督模式的主成分分析(Principal8component analysis,PCA)对大鼠肝脏组织、血清和尿液样本的代谢轮廓及其变化规律进行分析;然后以正交-偏最小二乘判别分析(Orthogonal signal correction filtered partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)结合“S-plot”寻找肝脏组织、血清和尿液中的差异代谢物,然后筛选出与衰老相关的潜在诊断标志物。(4)靶标代谢通路定量分析:通过对相应的潜在生物标志物进行MetPA分析,筛选出这些诊断标志物相应的代谢通路,已寻找出与衰老过程相关的靶标代谢通路。然后采用酶联免疫反应试剂盒对其相应的潜在生物标志物进行定量分析,并对该代谢通路相应的关键酶进行定量分析。结果:(1)成分分析:基于LC-MS对甘草水提物的化学成分进行分析,总共指认出21个化合物;(2)药效学结果:行为学结果显示D-gal导致了模型组大鼠认知功能显著性下降(p0.05),表明衰老大鼠模型复制成功,当给予甘草水提物后,其学习记忆功能明显得到改善(p0.01);肝脏HE染色结果显示,与空白组相比,模型组大鼠肝脏组织出现了明显的坏死性空洞,肝细胞结构明显被损伤、变性和坏死。当给予甘草水提物后,各给药组的HE染色结果均得到显著性改善,表明甘草水提物具有肝保护作用。海马组织经HE染色后,与空白组相比,D-gal诱导的衰老大鼠海马神经元排列紊乱,海马CA1区出现大面积的神经元坏死,胞质嗜酸性增强,细胞核固缩、溶解、消失。当给予甘草水提物后,各给药组的海马HE染色结果均得到显著性改善,表明甘草水提物具有神经保护作用。肝脏组织和海马组织中氧化应激和胆碱能系统功能相关指标测定结果显示,衰老大鼠肝脏组织和海马组织中SOD、GPx和CAT活性和ACh含量显著性下降,AChE活性和MDA含量显著性升高,表明D-gal诱导的衰老大鼠肝脏和海马组织处于过氧化应激状态,并且胆碱能功能发生紊乱。当给予甘草水提物后,SOD、GSH-Px和CAT活性和ACh含量显著性升高,AChE活性和MDA含量显著性下降,表明甘草水提物具有明显的抗氧化作用和调节胆碱能系统的作用。海马组织的Western blot实验结果显示,与空白组相比,衰老大鼠海马组织中Bax/Bcl-2比值,Caspase-3和Cyt-C蛋白表达量均显著性升高(p0.05),表明D-gal诱导的衰老大鼠海马组织出现明显的凋亡坏死;当给予甘草水提物后,Bax/Bcl-2比值和Caspase-3和Cyt-C蛋白表达量显著性(p0.05)降低,表明甘草水提物具有抑制神经元凋亡和神经保护作用。(3)代谢组学研究结果:肝脏代谢组学结果显示,对照组与模型组PCA图和OPLS-DA图能够明显分开,表明D-gal导致模型组大鼠内源性代谢物发生了明显改变。为了进一步探究甘草水提物是否对D-gal导致的代谢紊乱具有调节作用,对所有组别进行OPLS-DA分析,结果显示对照组、模型组和各给药组之间都能最大程度分开,且给药组具有明显回调趋势。为了寻找其潜在差异代谢物,本实验通过S-plot和VIP值寻找差异代谢物并对其进行t检验分析,共确定13个潜在生物标记物:α-葡萄糖、磷脂酰乙醇胺、糖原、肌酸、甜菜碱、缬氨酸、3-羟丁酸、胆碱、谷胱甘肽、甘氨酸、琥珀酸、牛磺酸和磷脂酰胆碱。其代谢通路富集分析结果依次是:(1)牛磺酸代谢;(2)缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成;(3)甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;(4)丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢。血清代谢组学分析结果显示,对照组与模型组PCA图和OPLS-DA图能够明显分开,表明D-gal诱导的衰老大鼠血清代谢轮廓发生显著性改变。为了进一步探究甘草水提物是否对D-gal导致的代谢紊乱具有调节作用,对所有组别进行OPLS-DA分析,结果显示对照组、模型组和各给药组之间都能最大程度分开,且给药组具有明显回调趋势。通过S-plot和VIP值寻找差异代谢物,共确定13个潜在生物标记物:异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、醋酸、谷氨酸、丙酮酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、TMAO、胱氨酸、牛磺酸和甘氨酸。其代谢通路富集分析结果依次是:(1)缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢;(2)牛磺酸代谢;(3)甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;(4)乙醛酸盐代谢;(5)丙酮酸代谢;(6)柠檬酸循环(TCA循环);(7)糖酵解和糖异生作用。尿液代谢组学分析结果显示,对照组和模型组的PCA和OPLS-DA能够明显分开,表明D-gal诱导的衰老大鼠血清代谢轮廓发生显著性改变。所有组的OPLS-DA分析结果显示,对照组、模型组和各给药组之间都能最大程度分开,且给药组具有明显回调趋势。通过S-plot和VIP值寻找差异代谢物,共确定14个潜在生物标记物:甘氨酸、肌酐、乳酸、牛磺酸、胍基乙酸、N-甲基烟酰胺、α-葡萄糖、柠檬酸、富马酸、肌酸、二甲基甘氨酸、α-酮戊二酸、乙酸和丙氨酸。其代谢通路富集分析结果依次是:(1)牛磺酸代谢;(2)甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;(3)乙醛酸盐代谢。(4)靶标代谢通路定量分析:牛磺酸代谢通路在肝脏、血清和尿液分析中均与衰老具有显著性相关性。采用酶联免疫吸附法测定牛磺酸含量及代谢相关的关键酶变化。牛磺酸含量测定结果显示,在模型组大鼠血清和尿液中牛磺酸水平显著性下降(p0.01),当给予甘草水提物后,衰老大鼠血清和尿液中的牛磺酸含量均显著性回调(p0.05)。I型半胱氨酸双加氧酶(cysteine dioxygenase,type I,CDO1)、半胱氨亚磺酸脱羧酶(Cysteinesulfinic acid decarboxylase,CSAD)和I型谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,type I,GAD1)均在牛磺酸合成中发挥主要作用。酶联免疫吸附法测定血清中CDO1、CSAD和GAD1活性结果显示,与空白组相比,模型组中CDO1(p0.01)、CSAD(p0.01)和GAD1(p0.01)活性均显著性降低;当给予甘草水提物后,CDO1(p0.01)和CSAD(p0.01)活性显著性回调,表明甘草水提物能够显著性调节牛磺酸合成。结论:(1)甘草水提物能够显著性改善D-gal诱导的衰老大鼠认知功能损伤和氧化应激损伤,并具有调节胆碱功能紊乱和抑制细胞的凋亡作用。(2)代谢组学研究结合多元统计分析发现牛磺酸代谢通路与D-gal诱导的大鼠衰老具有显著性相关性。(3)代谢通路验证结果显示甘草水提物能够明显改善机体牛磺酸合成,表明甘草水提物发挥抗衰老作用可能是通过调节牛磺酸合成来发挥作用的。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

水提物,总离子流,正离子,模式

甘草水提物LC-MS正离子模式（A）和负离子模式（B）总离子流图

实验大鼠,体重变化

4.1 各组实验大鼠的体重变化 (n=15；与模型组比较：**p＜0.宫实验和新物体识别实验忆功能衰退是衰老过程中伴随的常见现象，是一种脑功能 Morris 水迷宫实验对实验大鼠的空间学习记忆功能进行D-半乳糖诱导的衰老大鼠潜伏期较空白组显著性（p<0.0平台次数（图 4.2B）和目标象限停留时间（图 4.2C）较

【参考文献】