养胃解毒合剂对脓毒症大鼠肠道黏膜的保护作用及机制的实验研究

发布时间：2020-06-18 01:49

【摘要】：目的:通过观察养胃解毒合剂联合泰能对脓毒症模型大鼠肠黏膜的保护作用,并且围绕炎症、细胞凋亡以及肠黏膜屏障等指标,来探讨养胃解毒合剂保护肠粘膜防治脓毒症的作用机制。材料与方法:将140只大鼠随机分为7组:正常组20只、模型组20只、中药正常剂量组20只、中药高剂量(2倍)组20只、西药组(泰能)20只、西药+中药正常剂量组20只、西药+中药高剂量组20只。采用盲肠末端结扎并穿孔的手术方式复制脓毒症大鼠模型,按每kg体重大鼠的给药量为人的6.3倍计算,给予各组大鼠不同因素干预:正常组:予以生理盐水按照每100g体重1ml的剂量灌胃;模型组:模型复制成功后,予以生理盐水每100g体重1ml的剂量灌胃;中药正常剂量组:模型复制后,按每100g体重1ml剂量给予正常剂量中药(1ml药液含生药量1.4g,下同)灌胃;中药高剂量组:模型复制后,按每100g体重1ml剂量给予高剂量中药(1ml药液含生药量2.8g,下同)灌胃;西药组:模型复制后,泰能100mg每kg体重剂量日2次腹腔注射给药;西药+中药正常剂量组:模型复制后,泰能100mg每kg体重剂量日2次腹腔注射给药+正常剂量中药每100g体重1ml剂量灌胃;西药+中药高剂量组:模型复制后,泰能100mg每kg体重日2次腹腔注射给药+高剂量中药每100g体重1ml剂量灌胃。灌胃予以日2次,连续给药2天后,统计各组大鼠的死亡率,采集血清、回肠组织样本,检测各项指标。实验一:酶联免疫吸附测定方法(ELISA)检测各组大鼠血清标本TNF-α、IL-1β含量;观察回肠标本外观形态、观察各组大鼠回肠组织HE染色。实验二:酶联免疫吸附测定方法(ELISA)检测各组大鼠肠组织TNF-α、IL-1β含量。实时定量荧光PCR(Real-time PCR)法检测各组大鼠肠组织TNF-α、IL-1βm RNA表达。免疫印迹法(Western blot)检测肠组织炎症通路TLR2/4、NF-κB蛋白表达,检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达。实验三:免疫组织化学法(IHC)检测大鼠肠组织Occludin、Claudin-1和ZO-1表达及分布;实时定量荧光PCR(Real-time PCR)法检测各组大鼠肠组织中occludin,Claudin-1,ZO-1 m RNA表达;免疫印迹法(Western blotting)检测各组大鼠肠组织中Occludin,Claudin-1,ZO-1等蛋白的表达。结果:1.各组大鼠一般状态、生存率及回肠组织形态学改变1.1大鼠一般状态的变化正常组大鼠外表皮毛颜色、精神状态、反应灵敏度、活动状态、行为、摄食量、饮水量、大便排出方面均正常,体重增加较快;与正常组比较,模型组大鼠毛色干枯蓬松欠光滑易脱毛,精神萎靡,应激能力差,活动减少,拱背蜷缩,喜欢蜷缩在一起,进食量减少,手术伤口愈合度差,大便稀,有大鼠目色红;与模型组比较,中药正常剂量组及中药高剂量组大鼠毛色略有干枯,精神轻度萎靡,反应及活动尚可,时有蜷缩,进食及饮水量均比模型组增加,手术伤口愈合度尚可,大便质略稀,有大鼠目色红;与模型组比较,西药组及西药+中药正常剂量组有部分大鼠毛色略有干枯,精神轻度萎靡,反应及活动尚可,时有蜷缩,进食及饮水量均比模型组增加,手术伤口基本愈合,大便质略稀,有大鼠目色红;与模型组比较,西药+中药高剂量组大鼠毛色略有干枯,无精神萎靡,反应及活动基本正常,偶有蜷缩,进食及饮水量均比模型组增加,手术伤口愈合,大便质略稀,无大鼠目色红现象。1.2大鼠死亡率的变化正常组大鼠无死亡,死亡率为0;模型组大鼠死亡12只,死亡率为60%;中药正常剂量组共死亡大鼠11只,死亡率为55%;中药高剂量(2倍)组死亡大鼠11只,死亡率为55%、西药组(泰能)大鼠死亡10只,死亡率为50%、西药+中药正常剂量组大鼠死亡11只,死亡率为55%、西药+中药高剂量组大鼠死亡8只,死亡率为40%。1.3大鼠回肠组织形态学变化HE染色显示:正常组小肠上皮肠细胞形态正常,模型组小肠上皮组织水肿严重,大量炎症细胞浸润,能够见到大量坏死脱落的上皮细胞。中药正常剂量组、中药高剂量组、西药组、西药+中药正常剂量组和西药+中药高剂量组炎症细胞减少,水肿程度减轻,未见坏死脱落的上皮细胞,其中以中药高剂量组与西药+中药高剂量组尤为明显。2.各组大鼠肠组织TLR2、4-NF-κB炎症信号通路及调控相关因子的变化2.1各组大鼠肠组织TNF-α、IL-1β变化2.1.1各组大鼠肠组织TNF-α、IL-1β含量的变化与正常组对比,模型组中大鼠肠组织TNF-α、IL-1β含量显著增高,具有统计学意义(P0.01);与模型组相比,西药组、西药+中药高剂量组大鼠肠组织TNF-α水平均显著下降(P0.01),各治疗组大鼠肠组织IL-1β水平均显著降低(P0.01);与西药组相比,西药+中药高剂量组大鼠肠组织TNF-α水平均显著下降(P0.01),西药+中药高剂量组和西药+中药高正常剂量组大鼠肠组织IL-1β水平均显著下降(P0.01)。2.1.2各组大鼠肠组织TNF-α、IL-1βm RNA表达的变化与正常组相比,模型组大鼠小肠组织TNF-α、IL-1βm RNA表达水平显著增高,具有统计学意义(P0.01);与模型组相比,各干预组大鼠肠组织TNF-αm RNA表达水平均显著下降(P0.01),西药组和西药+中药高剂量组大鼠肠组织IL-1βm RNA表达水平均显著下降(P0.01);与西药组相比,西药+中药高剂量组大鼠肠组织TNF-α、IL-1βm RNA表达水平均下降,但无统计学意义(P0.05)。2.2大鼠肠组织TLR2、TLR4、NF-κB蛋白表达的变化与正常组相比,模型组大鼠肠组织TLR2蛋白水平显著升高(P0.01),TLR4、NF-κB水平升高(P0.05);与模型组相比,除中药正常剂量组肠组织NF-κB表达无影响外,其余各干预组大鼠肠组织TLR2、TLR4和NF-κB蛋白表达水平均下降(P0.05);与西药组相比,西药+中药高剂量组、中药正常剂量组和西药+中药正常剂量组大鼠肠组织TLR2蛋白表达水平均下降(P0.05),西药+中药高剂量组NF-κB蛋白表达水平均下降(P0.05)。3.各组大鼠肠组织凋亡因子的变化与正常组相比,模型组中大鼠肠组织Bax和Capase3蛋白表达显著增高,Bcl-2蛋白表达显著降低,具有统计学意义(P0.01);与模型组相比,西药+中药高剂量组大鼠肠组织Bax和Capase3水平均显著降低,Bcl-2表达显著增高(P0.01);与西药组相比,西药+养胃解毒合剂高剂量组大鼠肠组织Bax和Caspase3蛋白表达均显著降低,Bcl-2蛋白表达显著增高(P0.01)。4.各组大鼠肠黏膜屏障相关蛋白的变化4.1 IHC法检测大鼠肠黏膜屏障相关蛋白表达及分布4.1.1 IHC法检测大鼠肠黏膜屏障相关蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1表达及分布光镜下显示:正常组Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白在肠细胞膜周围可见大量棕黄色的阳性颗粒表达,排列有序;与正常组比较,模型组可见棕黄色的阳性颗粒表达减少,排列相对无序;与模型组相比较,各治疗组均可见棕黄色的阳性颗粒表达,数量上有明显增加,排列有序,西药加中药高剂量组尤为明显。4.1.2各组大鼠免疫组化平均灰度的表达变化Occludin:各组图像分析积分光密度:与正常组相比较,模型组积分光密度显著降低(P0.01);与模型组比较,西药组、西药加中药高剂量和西药加中药正常剂量组积分光密度显著升高(P0.01);与西药组比较,西药加中药高剂量和西药加中药正常剂量组积分光密度明显升高(P0.01)。Claudin-1:各组图像分析积分光密度:与正常组相比较,模型组积分光密度显著降低(P0.01);与模型组比较,各干预组积分光密度显著增高(P0.01),中药正常剂量组除外;与西药组比较,西药加中药高剂量和西药加中药正常剂量组积分光密度明显下降(P0.01)。ZO-1:各组图像分析积分光密度:与正常组相比较,模型组积分光密度显著降低(P0.01);与模型组比较,五个治疗组积分光密度均显著升高(P0.01)。4.2各组大鼠肠屏障功能相关m RNA表达的变化与正常组比较,模型组Occludin、Claudin-1、ZO-1 m RNA表达水平显著下调(P0.01);与模型组相比,西药组、中药高剂量组、西药+中药正常剂量组和西药+中药高剂量组Occludin、Claudin-1和ZO-1 m RNA表达显著升高(P0.01),其中以西药+中药高剂量组变化最显著,中药正常剂量组无显著改变;与西药组相比较,西药组+中药高剂量组Occludin基因m RNA表达有升高趋势,但差异无统计学意义,Claudin-1和ZO-1m RNA表达水平显著升高(P0.01),中药正常剂量组Occludin m RNA表达水平显著下降(P0.05)。4.3对各组大鼠回肠屏障功能相关蛋白表达的影响与正常组比较,模型组Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表达水平显著下调(P0.01),与模型组相比,各治疗组Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白表达显著升高(p0.01),其中以西药+中药高剂量组变化最为显著,且中药高剂量组变化显较中药正常剂量组变化更为显著。与西药组比较,中药高剂量组与中药正常剂量组Claudin-1显著降低(P0.01),中药正常剂量组ZO-1显著降低(P0.01),西药+中药高剂量组Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白表达显著升高(P0.01),西药+中药正常剂量组Occludin和ZO-1蛋白表达显著升高(P0.01)。结论:1.养胃解毒合剂联合泰能对脓毒症模型大鼠的肠粘膜有明显的保护作用,其中以中药高剂量组为优,养胃解毒合剂高剂量联合泰能能起到协同作用。2.养胃解毒合剂通过下调脓毒症模型大鼠炎症因子减轻其炎症反应。3.养胃解毒合剂通过调控脓毒症模型大鼠相关凋亡因子减少肠上皮细胞的凋亡。4.养胃解毒合剂通过上调脓毒症模型大鼠肠粘膜屏障相关蛋白的表达来保护肠黏膜。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

流程图,脓毒症,大鼠模型,流程图

图 1.制备脓毒症大鼠模型手术流程图2.2.2 干预方法于手术后 4 小时后进行用药，连续给药 2 天，①正常组：按每只 2ml/次的胃给予生理盐水，每日 2 次；②模型对照组：模型复制后，按每只 2ml/次的剂给予生理盐水，每日 2 次；③中药正常剂量组：模型复制后，给予正常剂量养胃剂 1ml/100g 灌胃，日 2 次灌胃；④中药高剂量组：模型复制后，给予高剂量养合剂 1ml/100g 灌胃，日 2 次灌胃；⑤西药组：模型复制后，给予泰能 100mg/(k次腹腔注射；⑥西药+中药正常剂量组：模型复制后，给予泰能 100mg/(kg.d)日注射，给予正常剂量养胃解毒煎剂 1ml/100g 灌胃，日 2 次灌胃；⑦西药+中药高模型复制后，给予泰能 100mg/(kg.d)日 2 次腹腔注射，给予高剂量养胃解毒煎剂 1灌胃，日 2 次灌胃。给药结束后，其中正常组死亡率 0、模型组死亡 12 只、中药量组死亡率 11 只、中药高剂量组死亡率 11 只、西药组（泰能）死亡 10 只、西正常剂量组死亡 11 只、西药+中药高剂量组死亡 8 只。

二甲苯,小肠病,溶液染色,脱水时间

图 2.模型组大鼠腹腔解剖图察各组大鼠小肠病理变化，方法如下：本肠组织，置于 10%福尔马林里进行固定。酒精进行脱水，浓度按顺序从 50%、70%、，每级酒精的脱水时间大概为 30 分钟。苯透明，然后再二甲苯Ⅰ和Ⅱ各透明 20 分予以切片，组织的切片厚度应为 5 微米。片没入二甲苯Ⅰ，20 分钟后洗去石蜡。标精 5 分钟，然后洗去二甲苯。无水酒精Ⅱ%、50%酒精中各浸入 5 分钟。苏木精溶液染色 3 分钟，然后用清水清洗应该上色（如细胞质）部分。用自来水冲

【相似文献】