心复康口服液干预心力衰竭大鼠心肌线粒体质量控制的机制研究

发布时间：2020-06-18 03:34

【摘要】：背景:目前,心力衰竭的治疗已进入平台期,需要深入研究其发病机制,找出对应的治疗方法。心肌线粒体是心脏能量代谢的主要场所,其功能紊乱是导致心肌收缩功能障碍以致心力衰竭的重要因素。线粒体是一个高度动态的细胞器,通过不断地生物合成、融合、分裂、线粒体自噬,使线粒体的形态、数量、质量达到平衡状态,称之为线粒体的质量控制。线粒体的质量控制是线粒体正常发挥其功能的基石,在心力衰竭的病理进程中有重要作用。由于线粒体质量控制是复杂的、多层次、多方面、相互影响的机制,这与中药多环节、多靶点、网络性的治疗理念不谋而合,因此开展中药治疗心力衰竭心肌线粒体功能障碍的机制研究,可能为心力衰竭的治疗提供新的思路和新的方向。目的:从线粒体的质量控制方面切入,探索心复康口服液对心力衰竭大鼠心肌线粒体生物合成、线粒体动力学(融合/分裂)、线粒体自噬方面的影响,阐释心复康口服液治疗心力衰竭的药理机制。方法:1.采用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法建立心肌梗死后心力衰竭模型;2.大鼠心功能的测定:所有大鼠分别于术前、术后及药物治疗8周后进行超声心动检测,采用彩色多普勒超声显像仪测定左室舒张末期内径(LVIDd)、左室收缩末期内径(LVIDs),计算出左室射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS);3.大鼠心肌形态学观察:通过光学显微镜HE染色、Masson染色,对大鼠心肌组织结构及心肌纤维化进行观察,通过透射电子显微镜对大鼠心肌超微结构进行观察;4.采用qPCR、Western blot的方法对大鼠心肌线粒体生物合成相关调控蛋白SIRT1/SIRT3与PGC-1a进行检测;5.采用Western blot的方法对大鼠心肌线粒体动力学相关蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1、Drp1、Fis1、Mff进行检测;6.采用冰冻切片-免疫荧光双标的方法检测大鼠心肌线粒体自噬相关蛋白parkin、p62、LC3与线粒体内膜标记蛋白COXIV共定位的情况,用IPP图像分析软件进行分析,用Pearson's correlation表示共定位的量,采用qPCR、Western blot的方法对大鼠心肌线粒体自噬相关蛋白pink1、parkin、p62、LC3进行检测。结果:1.心复康口服液对心力衰竭大鼠心功能的影响建立心梗后心力衰竭动物模型,药物干预8周后,检测各组大鼠心功能,分析数据得出:与假手术组相比,模型组LVIDd、LVIDs均增加,差异有显著统计学意义(p0.01),EF、FS均下降,差异有显著统计学意义(p0.01);与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组LVIDd、LVIDs均有降低,其中,卡托普利组LVIDs降低差异有统计学意义(p0.05),其余差异均无统计学意义(p0.05),此外,与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组EF、FS均增加,其中卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组EF增加差异有统计学意义(p0.01,p0.05),卡托普利组FS增加差异有统计学(p0.05),其余差异均无统计学意义(p0.05)。2.心复康口服液对心力衰竭大鼠心肌组织病理结构和心肌超微结构的影响(1)各组HE染色观察结果如下:假手术组:心肌形态结构正常,结构清晰,肌纤维排列整齐、致密,着色均匀。细胞核清晰,大小一致,未见炎性细胞浸润。模型组:心肌梗死灶范围较大,心肌细胞显著减少,梗死边缘区心肌细胞肥大。结构模糊,肌纤维排列紊乱,出现肌丝溶解、断裂。细胞核出现核碎裂、核溶解。大量炎性细胞浸润。卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组:心肌组织病变较模型组减轻,心肌细胞部分坏死,梗死灶范围减小,心肌细胞肥大减轻。心肌纤维排列较疏松,细胞核大小不均匀,肌丝部分断裂,有部分炎性细胞浸润。(2)各组Masson染色观察结果如下:假手术组:心肌组织形态正常,心肌细胞排列整齐、紧密,细胞间隙有少量散在的胶原纤维。模型组:梗死区心肌细胞大量坏死,由胶原纤维代替。梗死边缘区,细胞排列松散,细胞间隙充满大量胶原纤维。卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组:梗死区及梗死边缘区胶原纤维较模型组明显减少,心肌细胞排列较紧密,细胞间隙有较少的胶原纤维。(3)各组心肌超微结构观察如下:假手术组:心肌结构良好,心肌纤维排列整齐,横纹清晰,肌节完整,肌纤维间线粒体较多,线粒体形态正常,结构完整,线粒体膜结构清晰,内部嵴清晰且排列紧密,未见肿胀、空泡,偶见自噬体。模型组:心肌结构受损严重,心肌纤维排列疏松、紊乱,走形不规则,出现断裂。肌节欠完整,横纹欠清晰,线粒体内部嵴排列紊乱,膜结构破坏,出现线粒体肿胀,自噬体明显,空泡化明显,线粒体数量减少。卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组:心肌纤维排列较整齐,肌节尚规则,横纹稍模糊,线粒体出现不同程度的肿胀、膜损伤,嵴排列较紊乱。线粒体周边可见自噬相关单侧膜结构及髓样体等。3.心复康口服液对心力衰竭大鼠心肌SIRT1/SIRT3、PGC-1α的影响通过对各组大鼠心肌组织中SIRT1/SIRT3、PGC-1α的mRNA含量检测,分析数据得出:与假手术组相比,模型组SIRT1的mRNA水平明显升高,SIRT3、PGC-1α的mRNA水平明显降低,差异均有统计学意义(p0.05);与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组SIRT1的mRNA水平均有不同程度的降低,其中卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组降低的差异有统计学意义(p0.05),此外,与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组SIRT3、PGC-1α的mRNA水平均有不同程度的升高,其中,心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组SIRT3的mRNA水平升高差异有统计学意义(p0.05),心复康中剂量组PGC-1α的mRNA水平升高差异有统计学意义(p0.05),其余差异均无统计学意义(p0.05)。通过对各组大鼠心肌组织中SIRT1/SIRT3、PGC-1α的蛋白相对表达量的检测,分析数据得出:与假手术组相比,模型组SIRT1、SIRT3、PGC-1α的蛋白表达水平均明显降低,差异均有统计学意义(p0.05,p0.01,p0.01);与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组SIRT1、SIRT3、PGC-1α的蛋白表达水平均有不同程度的升高,其中,卡托普利组SIRT1表达升高差异具有统计学意义(p0.05),心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组SIRT3的蛋白表达水平升高差异有统计学意义(p0.05),心复康大剂量组PGC-1α的蛋白表达水平升高差异有统计学意义(p0.05),其余差异均无统计学意义(p0.05)。4.心复康口服液对心力衰竭大鼠心肌线粒体动力学的影响通过对各组大鼠心肌线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1相对表达量的检测,分析数据得出:与假手术组相比,模型组Mfn1、Mfn2、Opa1的蛋白表达水平均明显降低,差异均有显著统计学意义(p0.01);与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组Mfn1、Mfn2、Opa1的蛋白表达水平均有不同程度的升高,其中,卡托普利组Mfn1表达升高差异具有统计学意义(p0.05),卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组Mfn2的蛋白表达水平升高差异有统计学意义(p0.05),卡托普利组、心复康中剂量组、心复康小剂量组Opa1的蛋白表达水平升高差异有统计学意义(p0.05),其余差异均无统计学意义(p0.05)。通过对各组大鼠心肌线粒体融合相关蛋白Drp1、Fis1、Mff相对表达量的检测,分析数据得出:与假手术组相比,模型组Drp1、Fis1、Mff的蛋白表达水平均明显升高,差异均有显著统计学意义(p0.01,p0.05,p0.01);与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组Drp1、Fis1、Mff的蛋白表达水平均有不同程度的降低,其中,心复康中剂量组、心复康小剂量组Fis1的蛋白表达水平降低差异有统计学意义(p0.05),卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组Mff的蛋白表达水平降低差异有统计学意义(p0.05,p0.01,p0.01,p0.05),其余差异均无统计学意义(p0.05)。5.心复康口服液对心力衰竭大鼠心肌线粒体自噬的影响(1)心肌线粒体自噬相关蛋白荧光共定位情况与假手术组相比,模型组parkin与COXⅣ共定位的量显著升高,差异有统计学意义(p0.05);与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组共定位的量均有降低,其中心复康大剂量组降低差异有统计学意义(p0.05),其余各组降低差异均无统计学意义(p0.05)。与假手术组相比,模型组p62与COXⅣ共定位的量显著升高,差异有统计学意义(p0.05);与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组共定位的量均有降低趋势,但差异均无统计学意义(p0.05)。与假手术组相比,模型组LC3与COX Ⅳ共定位的量显著升高,差异有统计学意义(p0.05);与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组共定位的量均有降低趋势,其中,卡托普利组共定位的量略有降低,差异均无统计学意义(p0.05),心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组共定位的量均显著降低,甚至略低于假手术组,且与模型组相比,差异有统计学意义(p0.05,p0.05,p0.01)。(2)大鼠心肌组织中pink1、parkin、p62、L.C3mRNA及蛋白表达情况通过对各组大鼠心肌组织中pink1、parkin、p62、LC3的mRNA含量检测,分析数据得出:与假手术组相比,模型组pink1的mRNA水平明显降低,parkin、LC3的mRNA水平明显升高,差异均有显著统计学意义(p0.01),p62的mRNA水平亦明显升高,差异有统计学意义(p0.05);与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组pink1的mRNA水平均有不同程度升高,其中心复康小剂量组升高的差异有统计学意义(p0.05),此外,与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组parkin、p62、LC3的mRNA水平均有不同程度的降低,其中,卡托普利组parkin、LC3的mRNA水平降低差异有统计学意义(p0.05,p0.01),心复康中剂量组、心复康小剂量组parkin、LC3的mRNA水平降低差异有统计学意义(p0.01),其余差异均无统计学意义(p0.05)。通过对各组大鼠心肌组织中pink1、parkin、p62、LC3的蛋白相对表达量的检测,分析数据得出:与假手术组比较,模型组pink1、parkin、p62蛋白表达水平降低,差异均有显著统计学意义(p0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高,差异具有统计学意义(p0.05);与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组的pink1、parkin、p62蛋白表达水平均有不同程度升高,其中,卡托普利组parkin、p62蛋白表达水平升高差异有统计学意义(p0.05),心复康中剂量组parkin、p62蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(p0.01,p0.05),此外,与模型组相比,卡托普利组、心复康大剂量组、心复康中剂量组、心复康小剂量组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均有不同程度的降低,其中心复康中剂量组和心复康小剂量组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低较明显,差异具有统计学意义(p0.05),其余差异均无统计学意义(p0.05)。结论:1.心复康口服液及卡托普利能够降低心力衰竭大鼠的LVIDd、LVIDs,升高EF、FS,进而抑制心力衰竭大鼠左室重构,增强心脏泵血功能。2.心复康口服液及卡托普利能够减轻心力衰竭大鼠心肌病理结构损伤及心肌纤维化,对心肌超微结构有明显的改善作用。3.心复康口服液及卡托普利能明显上调SIRT1、PGC-1α、SIRT3的表达,进而减轻心力衰竭大鼠心肌线粒体生物合成功能的损伤,起到促进心肌能量代谢的作用。4.心复康口服液及卡托普利通过上调线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1,下调线粒体分裂蛋白Drp1、Fis1、Mff,促进线粒体融合,抑制线粒体分裂,起到调控心力衰竭大鼠心肌线粒体动力学,恢复线粒体动力学平衡状态的作用。5.心复康口服液及卡托普利可以通过pink1/parkin通路抑制心力衰竭大鼠心肌线粒体自噬过度的状态。6.心复康口服液及卡托普利可以通过调控线粒体生物合成、线粒体动力学、线粒体自噬,影响心力衰竭大鼠心肌的线粒体质量控制,起到促进心肌能量代谢,改善心功能的作用。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

图２各组ＨＥ染色图逡逑

心复康口服液干预心力衰竭大鼠心肌线粒体质量控制的机制研究

图３各组Ｍａｓｓｏｎ染色图逡逑

【参考文献】