硫磺熏蒸对天麻和牛膝药材质量的影响

发布时间：2020-06-18 10:39

【摘要】：在中医药领域,硫熏加工方法作为传统的中药材养护方法,具有快速干燥、漂白、防霉、防虫和延长贮藏期等作用,已广泛应用到中药材的初加工和仓储等环节。当前中药材硫熏滥用现象极为普遍,尤其是产地加工和贮藏保管等环节。一方面,二氧化硫是国内外允许使用的一种食品添加剂,多以亚硫酸盐的形式添加到食品中,发挥防腐、漂白和抗氧化的作用。另一方面,过度硫熏产生的大量二氧化硫不仅会影响药材质量,改变药材化学成分,甚至危害人体健康。如何制定切实可行的中药材硫熏工艺,使之既能发挥硫熏防虫防霉的养护作用,又能最大限度降低二氧化硫残留危害是急需解决的问题。针对中药材硫熏以及二氧化硫残留带来的问题,国内外虽然制定了二氧化硫限量标准,但各国限量标准不一致,有些国家制定的标准过于严苛,并不适合中药材二氧化硫残留评价。考虑到空气中含有二氧化硫,植物本身也含有硫,甚至一些中药材本身就有含硫化合物(如天麻),这就会导致某些中药材即使不经硫熏,也会出现二氧化硫超标的情况。故当前中药材二氧化硫限量标准的合理性还需进一步验证。另外,针对中药材使用特点和用药习惯,有必要研究并制定符合的中药材的二氧化硫限量标准。此外,在评价中药材硫熏程度方面,仅以二氧化硫作为质控指标是不够的,缺少稳定可靠的中药材硫熏标志物作为内在质控指标。因此,本论文首先进行中药材二氧化硫风险评估,在此基础上选取硫熏较为严重的天麻和牛膝为研究对象,从硫熏工艺和硫熏标志物方面对其药材质量和安全性进行了系统性研究。研究结果如下:1.结合中药使用特点和用药习惯开展中药材二氧化硫风险评估根据美国环保局提出的THQ风险评估模型和JECFA规定的二氧化硫每日容许摄入量(ADI=0.7mg/(kg·d)),综合考虑中药用药特点和暴露频率、暴露时间等指标,对中药材二氧化硫最大暴露风险进行评价,计算更为科学合理的二氧化硫限量标准值。最终得到中药材中二氧化硫最大残留限量值为750 mg/kg,极大地降低了中药材二氧化硫超标率。这与食品添加剂法典标准中规定的蔬菜水果类的二氧化硫限量值(500～1000mg/kg)相一致。尤其是考虑到药材并不像食品一样每天都会食用,故该参考值更加符合中药材的使用特点和用药习惯。2.基于代谢组学和硫熏工艺探讨硫磺熏蒸对天麻药材质量的影响为了寻找稳定可靠的内在硫熏质控指标,本论文采用基于UPLC-Q-TOF-MS的代谢组学技术和多元统计分析方法对天麻硫熏前后药材质量进行差异分析。结果从天麻药材中得到6种硫熏标志物,包括2个含硫的酚酸类成分(p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite 和p-mercaptobenzyl hydrogen sulfate),1 个含硫的二糖类成分(3-O-(6-O-sulfo-β-D-galactopyranosyl)-β-D-glucopyranose),1 个糖酯类成分(Gingerglycolipid B),2 个磷脂类成分(Phosphatidylinositol(18:2/0:0)and Phosphatidylinositol(0:0/18:2))。其中,p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite 作为硫熏天麻中丰度较高且专属性较好的硫熏标志物,是判断天麻硫熏与否的重要质控指标。为了实现市场和产地天麻硫熏程度的检测,本研究对天麻中硫熏标志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite进行化学合成和分离纯化,并建立了该天麻硫熏标志物的定量分析方法。通过考察不同贮藏时间和加热处理对该硫熏标志物的影响,发现该标志物在贮藏过程中(0～8个月)稳定性好,且不同加热温度(50℃、60℃、70℃和80℃)和加热时间(2h、4h、8h、12h和24h)对其影响较小。故该标志物可作为评价天麻硫熏与否以及硫熏程度的重要指标。为进一步研究硫熏对天麻药材质量的影响程度,本论文建立了 UPLC同时测定天麻药材中8种化学成分(腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷E)的定量分析方法。在此基础上,探讨了产地加工环节不同硫磺熏蒸工艺,贮藏环节不同贮藏时间以及煎煮处理对硫熏天麻药材化学成分和二氧化硫残留量的影响。通过考察不同硫磺用量(硫磺与药材比1:20、1:40、1:80)和熏蒸时间(0～24h)对天麻药材质量的影响,得到1:40组熏蒸1h以内,恰好能够将天麻药材表面熏透,且能保证药材中二氧化硫残留量在限量值(750mg/kg)以内。经综合评价,最终确定既能保证药材质量和控制二氧化硫残留量,又能达到较好的防霉的效果的最佳硫熏工艺为硫磺与药材用量比1:40,熏蒸1h。通过不同贮藏时间考察,硫熏天麻药材中二氧化硫残留量在贮藏过程中逐渐降低,且在贮藏4个月后,其残留量会降低50%以上。另外,在硫熏天麻煎煮过程中发现大量的二氧化硫会随着水蒸气扩散到大气中,仅有少量化学成分和二氧化硫会随着水煎液进入到人体。本研究针对硫熏天麻标志物和硫熏天麻药材提取物进行了体外细胞安全性评价。首先考察了不同剂量天麻硫熏标志物p-hydroxybenzyl hydrogen sulfite对人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)、人正常肝细胞(L-02)和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC-12)活力的影响。结果表明该成分对于人体的肝细胞和肾细胞生长均表现出良好的促进作用,且参照《美国药典》的毒性分级法,认为该成分对PC-12细胞的安全剂量范围为0～1000 μmol/L,即在0～1000 μmol/L浓度范围内,该成分不存在细胞毒性。此外,按照本研究制定的最佳硫熏工艺进行天麻药材硫熏处理后,对其药材水提物进行上述3种细胞活力研究,发现硫熏后天麻提取物对上述3种细胞的无细胞毒性,表明该硫熏工艺能够较好地保证药材质量安全。3.基于代谢组学和硫熏工艺探讨硫磺熏蒸对牛膝药材质量的影响本论文采用代谢组学技术和多元统计分析方法对牛膝硫熏前后药材质量进行差异分析,寻找特异性的硫熏标志物。结果发现,从牛膝药材共鉴定得到5个显著性差异成分,包括未硫熏牛膝中3个三萜苷类差异成分(BetavulgarosideⅣ、Betavulgaroside Ⅲ、Betavulgaroside Ⅱ)和硫熏牛膝中2个酰胺类差异成分(阿魏酰-3-甲氧基酪胺(Feruloyl-4-O-methyldopamine)和阿魏酰基酪胺(Moupinamide)),未发现专属性较好的含硫标志物。建立了 UPLC-MS同时测定牛膝药材中5种化学成分(β-蜕皮甾酮、甜菜碱、齐墩果酸、阿魏酸、5-羟甲基糠醛)的定量分析方法。在此基础上,探讨了不同硫磺用量和硫熏时间对牛膝药材化学成分和二氧化硫残留量的影响。结果发现,硫磺与药材用量1:80熏蒸2 h以内对药材化学成分影响不大,并且按照硫磺与药材用量1:40熏蒸1 h以内能够最大限度减小对牛膝药材质量的影响,又能控制药材中二氧化硫残留量在限量值(750mg/kg)以内。另外,按照本研究制定的最佳硫熏工艺进行牛膝药材硫熏处理后,对其药材水提物进行人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)、人正常肝细胞(L-02)和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC-12)3种细胞活力研究,发现在正常的浓度范围内,硫熏牛膝提取物与未硫熏药材提取物相比,对HK-2、L-02和PC-12细胞活力和细胞毒性无细胞毒性。进一步验证本研究制定的硫熏工艺能够较好地保证药材质量安全。综上,本研究建立了中药材二氧化硫风险评估模型,得到二氧化硫最大残留理论限量值;并在此基础上,制定了一套合理可行的中药材硫磺熏蒸质量控制研究方案,可用于快速寻找特征性硫熏标志物,获得了安全可靠的硫熏天麻特异性质控指标,并确定了天麻和牛膝药材的最佳硫熏工艺。本研究为其他硫熏中药材的质量控制和安全性评价提供思路,同时也为中药材二氧化硫限量标准的制定提供参考。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R282.4
【图文】：

芦丁,天麻,总离子流,提取液

图３－２不同提取溶剂的天麻提取液总离子流图逡逑Ａ：邋５０％乙醇；Ｂ：邋５０％甲醇；Ｃ：纯水逡逑

天麻,芦丁,总离子流,提取液

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【参考文献】