鬼臼毒素衍生物P100抗肿瘤多药耐药作用及机制研究

发布时间：2020-06-19 09:25

【摘要】：目的:本文以多种肿瘤细胞和小鼠H22肝癌移植瘤为实验对象,研究鬼臼毒素衍生物P100的抗肿瘤作用,同时以K562细胞及多药耐药K562/A02细胞为实验对象研究肿瘤多药耐药机制以及P100抗多药耐药的机制。方法:1通过MTT法检测K562/A02细胞的多药耐药性及P100对多种肿瘤细胞的抑制效果。2建立小鼠H22肝癌移植瘤模型,通过尾静脉一次注射P100(5,10,20mg/kg’weight)药液评价体内抗肿瘤作用。3通过Hoechst33342、PI染色法观察P100诱导K562细胞及K562/A02细胞的凋亡形态;DAPI染色法观察P100诱导K562/A02细胞的凋亡形态。4流式细胞术检测P100诱导K562细胞及K562/A02细胞凋亡的凋亡率5实时荧光定量PCR法检测K562细胞及P100作用K562/A02细胞后PI3K基因、Akt基因、NF-κB基因、MDR-1基因、MRP基因、Caspase3基因、Caspase9基因mRNA表达的影响6 Western Blot法检测K562细胞及P100作用K562/A02细胞后PI3K p110α蛋白、Akt1蛋白、Phospho-Akt1蛋白、IκBα蛋白、Phospho-IκBα蛋白、NF-κB p65蛋白、Phospho-NF-κB p65蛋白、P糖蛋白、Caspase3蛋白、Cleaved Caspase3蛋白、Caspase9蛋白、Cleaved Caspase9蛋白、Caspase8蛋白及Cleaved Caspase8蛋白表达的影响7通过RNAi技术干扰K562A/02细胞中MDR-1基因、NF-κB P65基因、Akt1基因的表达,检测K562A/02细胞对阿霉素的耐药性及相关蛋白表达的变化。结果:1 MTT法检测结果发现K562A/02细胞对多种作用机制不同的抗肿瘤药物均有明显耐药性;P100对H4细胞、Hela细胞、A549细胞、MCF-7细胞、k562细胞、k562/a02细胞均有较好的抑制活性(ic50值范围:0.06μmol/l~9.6μmol/l),而且抑制活性普遍高于阳性药物vp-16,尤其对多药耐药细胞k562/a02,阳性对照药vp-16的抑制效果较差(ic50值:21.83±4.78μmol/l),而p100能有效抑制k562a/02细胞生长(ic50值:4.90±0.86μmol/l)。另外,p100对人正常血管内皮细胞926、心肌细胞h9c2均无明显毒性。2小鼠h22移植瘤实验结果显示:不同浓度的p100(5,10,20mg/kg’weight)对小鼠肝癌移植瘤生长有明显的抑制,抑制率分别达到31.3%、50.6%、70.0%。阳性对照药vp-16(20mg/kg’weight)抑制率为51.3%。3hoechst33342、pi染色结果显示k562细胞及k562a/02细胞形态完整,随着不同浓度p100作用,细胞开始出现不规则形态,细胞发生皱缩、碎裂,有凋亡小体产生。随药物浓度增加凋亡越明显;dapi染色结果显示随着不同浓度p100作用,k562/a02细胞开始皱缩,部分细胞胞核固缩。4流式细胞术检测结果显示不同浓度的p100(1μmol/l、2μmol/l、4μmol/l)诱导k562细胞发生凋亡,凋亡比例分别为23.92±2.15%、54.37±4.97%、65.09±5.63%,vp-16(4μmol/l)组的凋亡比例为43.46±2.30%。p100(2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l)诱导k562/a02细胞发生凋亡,凋亡比例分别为16.06±1.23%、27.29±3.36%、55.56±2.69%,阳性对照药vp-16(10μmol/l)组的凋亡比例为21.08±3.76%。可见p100诱导k562及k562/a02细胞凋亡能的力明显强于vp-16。5实时荧光定量pcr结果显示k562a/02细胞比k562细胞中pi3k基因、akt1基因、nf-κb基因、mdr-1基因、mrp基因mrna表达升高,不同浓度p100(2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l)作用后可下调k562a/02细胞pi3k基因、akt基因、nf-κb基因、mdr-1基因、mrp基因mrna表达,并上调caspase9基因、caspase3基因mrna表达。6westernblot检测结果显示k562a/02细胞比k562细胞中pi3kp110α蛋白、phospho-akt1蛋白、phospho-iκbα蛋白、nf-κbp65蛋白、phospho-nf-κbp65蛋白、p糖蛋白表达升高。不同浓度p100(2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l)作用k562a/02细胞后,可下调pi3kp110α蛋白、Phospho-Akt1蛋白、Phospho-IκBα蛋白、NF-κB p65蛋白、Phospho-NF-κB p65蛋白、P糖蛋白及Caspase9蛋白、Caspase8蛋白、Caspase3蛋白表达,并上调Fas蛋白、Cleaved Caspase9蛋白、Cleaved Caspase8蛋白、Cleaved Caspase3蛋白表达。7转染MDR-1 shRNA抑制了K562A/02细胞P糖蛋白表达,增强了细胞对阿霉素的敏感性,与shRNA对照组(NC)比较,IC50值由17.13±3.05μmol/L降至9.28±0.53μmol/L;转染NF-κB p65 sh RNA抑制了K562A/02细胞Phospho-NF-κB P65蛋白的表达,并下调了P糖蛋白表达,细胞对阿霉素的敏感性增加,与shRNA对照组(NC)比较,IC50值由17.13±3.05μmol/L降至11.53±1.52μmol/L。转染Akt1 siRNA抑制了K562A/02细胞中Akt1基因及Phospho-Akt1蛋白的表达,而细胞中P糖蛋白表达和细胞对阿霉素的敏感性无改变,但是降低了NF-κB基因的表达。结论:P100能抑制多种肿瘤细胞及多药耐药细胞的体外增殖,在体内对小鼠H22肝癌移植瘤同样有显著的抑制作用,与阳性对照药VP-16相比具有以下优点:(1)具有良好的理化性质,水溶性较VP-16高100倍以上;(2)对正常细胞毒性较VP-16明显降低,体外抗肿瘤活性和抗瘤谱优于VP-16;(3)对多药耐药细胞K562/A02的活性较VP-16高近5倍。P100不仅可以诱导K562凋亡而且还可以诱导多药耐药细胞K562/A02发生明显凋亡,相同剂量下VP-16仅能诱导K562凋亡而不能诱导K562/A02发生明显凋亡。多药耐药细胞K562/A02与亲本细胞K562之间在P糖蛋白及PI3K/Akt通路、NF-κB炎症通路活化上有巨大差异,这提示耐药表型P糖蛋白的表达与PI3K/Akt通路及NF-κB炎症通路密切相关。而P100对多药耐药细胞K562A/02的作用机制可能与抑制PI3K/Akt通路、抑制NF-κB通路导致P糖蛋白下调,另外启动Fas凋亡途径及Caspase级联反应相关。这些结果说明P100在抗肿瘤多药耐药过程中通过多个靶点进行作用进而克服多药耐药。因此,P100作为一种新型化合物,对于抗肿瘤多药耐药类药物的研究非常有价值。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：

移植瘤,小鼠,体重

31图 1 P100 对小鼠 H22 移植瘤及体重影响的结果Fig.1Effects of P100 on H22 transplanted tumor and weight in mousCompared with control,*P<0.05;**P<0.01

脏器,移植瘤,小鼠

32 2 HE 染色观察 P100 对小鼠 H22 移植瘤及脏器的影cts of P100 on H22 transplanted tumors and organs in mby hematoxylin-eosin staining. A: control (0.2 mL norma0 mg/kg weight); C: P100 (5 mg/kg weight); D: ight); E: P100 (20 mg/kg weight).

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