野生与种植黄连总生物碱总蛋白的检测及其盐酸小檗碱的生源代谢酶初探

发布时间：2020-06-20 10:26

【摘要】：目的:本文以黄连为研究对象,采用HPLC和UV测定野生与种植黄连不同部位有效成分盐酸小檗碱及总生物碱的含量,盐酸小檗碱亲和介质的制备及蛋白质SDS-PAGE垂直电泳技术,通过比较分析野生与种植黄连植株不同部位生物碱的含量,分析野生与种植黄连不同部位的差异蛋白,以期建立黄连植物体中盐酸小檗碱的生源代谢途径,为确保优质药材种植资源及质量控制研究提供依据。方法:紫外分光光度法200-600 nm全波长扫描后采用测定波长345 nm。HPLC采用C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,乙腈和0.4%磷酸水溶液等度洗脱,流速1.0 mL/min,进样量10μL,检测波长345 nm,柱温30℃。通过制备盐酸小檗碱亲和介质钓取其相关代谢酶,采用SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝法,以蛋白条带丰度、蛋白分子的相对分子量、A_(595 nm)和每克药材中蛋白质含量为指标,比较水提法、Tris-HCl法、硫酸铵沉降法所得黄连蛋白的差异,并对野生与种植黄连不同部位蛋白质的差异进行分析与评价。结果:种植黄连植株的总生物碱含量中根茎、须根和茎叶含(9.875±0.029)%、(6.406±0.033)%、(1.924±0.037)%,种植黄连植株的盐酸小檗碱含量中根茎、须根和茎叶含(0.4505±0.0373)%、(0.1673±0.0331)%、(0.0879±0.0293)%。野生黄连植株的总生物碱含量中根茎含(7.953±0.028)%、茎叶含(0.644±0.031)%,野生黄连植株的盐酸小檗碱含量中根茎含(0.3802±0.0323)%、茎叶含(0.1597±0.0315)%。优选得出最佳黄连蛋白质提取方法为Tris-HCl法,该法所提取的黄连蛋白丰度最高,且每克药材中蛋白质含量最高;野生与种植黄连不同部位蛋白质的差异明显,蛋白质丰度及每克药材中蛋白质含量顺序均为:种植黄连根茎野生黄连根茎种植黄连茎叶野生黄连茎叶种植黄连须根,并且聚类分析可知野生与种植黄连根茎蛋白关联关系较为显著,与其他部位蛋白关联不显著。结论:野生与种植黄连植株不同部位的生物碱含量存在明显差异,在种植黄连植株根茎的盐酸小檗碱和总生物碱含量均明显高于其须根和茎叶部位的;在野生黄连植株根茎的含量也远高于其茎叶部位的;种植黄连根茎高于野生黄连根茎。就总生物碱的含量而言,种植黄连根茎的含量最高,质量最佳。本研究优选的Tris-HCl法可以充分提取黄连中的蛋白质;野生与种植的黄连根茎的蛋白明显高于其他部位,且种植6年生的黄连根茎蛋白含量高于野生未知年限黄连根茎。黄连不同部位蛋白质的差异性既为其初级次级代谢成分及代谢途径研究奠定基础,也为黄连药材种质资源研究及质量控制评价提供依据。
【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284.1
【图文】：

标准曲线,标准曲线,牛血清白蛋白,蛋白电泳

图 2-1 三种方法的 SDS-PAGE 蛋白电泳图Figure 2-1 Electrophoresis of SDS-PAGE protein in three methods清白蛋白标准曲线的绘制所得牛血清白蛋白标准曲线见图 2-2，牛血清白蛋白标准曲线方82·C+0.01648，r=0.9991。

标准曲线,牛血清白蛋白,标准曲线,波长扫描

25-2 牛血清白蛋白标准曲线的绘制（a：1 号管 700-500nm 波长扫描；b：牛血清白蛋白标准re 2-2 bovine serum albumin standard curve drawing (a: 1 tube 700-500 nm wavelength scabovine serum albumin standard curve)提取方法的蛋白质含量提法、Tris-HCl 法、硫酸铵沉降法的考马斯亮蓝法测定的蛋白质含量见表

【参考文献】