补肾法提高小鼠体外培养卵母细胞抗氧化能力与调控ERK5-Keap1-Nrf2信号通路的关系

发布时间：2020-06-20 12:10

【摘要】：目的:卵母细胞在体外培养过程中,易受培养环境的影响引发氧化应激,导致其质量下降。本课题组在前期研究证实补肾法能提高卵巢抗氧化能力、改善卵母细胞线粒体功能的基础上,研究补肾法对体外培养卵母细胞抗氧化能力的影响及其对ERK5-Keap1-Nrf2信号通路的调控作用,以期揭示补肾法提高体外培养卵母细胞抗氧化能力的作用及机制,丰富中医“肾主生殖”理论。方法:1.大鼠含药血清的制备选用20只6周龄健康雌性SD大鼠,制备得补肾调经方含药血清。2.小鼠卵母细胞的体外培养选用D24-26天的雌性昆明小鼠32只,将小鼠卵母细胞随机分为4组:正常组、模型组、补肾组、NAC组。机械法分离卵巢,收集卵母细胞于37℃,5%CO_2,100%湿度的培养箱中,培养14h:倒置显微镜下观察卵母细胞PB1排出率,采用Oosight软件观测纺锤体形态,采用MDA、SOD、GST试剂盒分别检测卵母细胞MDA含量及SOD、GST活性。选用D24-26天的雌性昆明小鼠45只,将小鼠卵母细胞随机分为5组:正常组、模型组、补肾组、NAC组、ERK5抑制剂组。卵母细胞收集及培养方法如上,培养6h:采用实时荧光定量PCR法检测卵母细胞ERK5、Nrf2、Keap1 mRNA,检测Nrf2下游抗氧化酶SOD、CAT mRNA表达。结果:1.各组卵母细胞PB1排出率的比较与正常组比较,模型组卵母细胞PB1排出率显著降低(P0.01),补肾组、NAC组与正常组比较卵母细胞PB1排出率差异无统计学意义(P0.05);与模型组比较,补肾组、NAC组卵母细胞PB1排出率显著增高(P0.01),NAC组与补肾组比较差异无统计学意义(P0.05)。2.各组卵母细胞纺锤体形态的比较正常组卵母细胞具有正常的桶状纺锤体形态;模型组卵母细胞形态发生了轻度皱缩或不规则改变,且观测到不正常的狭长纺锤体;补肾组和NAC组具有正常的纺锤体形态。3.各组卵母细胞MDA含量,SOD活性及GST活性的比较MDA含量:与正常组比较,模型组MDA含量显著升高(P0.01),补肾组、NAC组与正常组之间无统计学意义(P0.05);与模型组比较,NCA组MDA含量降低(P0.05),补肾组MDA含量显著降低(P0.01);补肾组与NAC组之间MDA含量无统计学意义(P0.05)。SOD活性:与正常组对比,模型组SOD活性显著降低(P0.01),补肾组、NAC组与正常组之间无统计学意义(P0.05);与模型组比较,补肾组、NAC组SOD含量显著升高(P0.01),补肾组与NAC组之间SOD含量无统计学意义(P0.05)。GST活性:与正常组对比,模型组GST含量显著降低(P0.01),补肾组、NAC组与正常组之间无统计学意义(P0.05);与模型组比较,补肾组、NAC组GST含量升高(P0.05),补肾组与NAC组之间GST含量无统计学意义(P0.05)。4.各组卵母细胞ERK5、Keap1、Nrf2 mRNA表达比较ERK5 mRNA表达:与正常组比较,模型组ERK5 mRNA表达升高(P0.05),补肾组、NAC组表达显著升高(P0.01),抑制剂组与正常组比较无统计学意义(P0.05);与模型组比较,补肾组、NAC组表达升高(P0.05),抑制剂组表达降低(P0.05);与抑制剂组比较,补肾组和NAC组表达均显著升高(P0.01);补肾组与NAC组之间无统计学意义(P0.05)。Keap1 mRNA表达:正常组、模型组、补肾组、NAC组及抑制剂组之间Keap1 mRNA表达比较,差异均无统计学意义(P0.05)。Nrf2 mRNA表达:与正常组比较,模型组、补肾组、NAC组、抑制剂组表达显著升高(P0.01);与模型组比较,补肾组、NAC组表达显著升高(P0.01),抑制剂组表达升高(P0.05);与补肾组、NAC组比较,抑制剂组表达降低(P0.05);补肾组与NAC组之间无统计学意义(P0.05)。5.各组卵母细胞MnSOD、CAT mRNA表达比较Mn SOD mRNA统计结果:与正常组比较,补肾组、NAC组、抑制剂组表达显著升高(P0.01),模型组升高(P0.05);与模型组比较,补肾组、NAC组表达显著升高(P0.01),抑制剂组表达升高(P0.05);与补肾组、NAC组比较,抑制剂组表达降低(P0.05);补肾组与NAC组之间无统计学意义(P0.05)。CAT mRNA统计结果:与正常组比较,模型组、抑制剂组、补肾组、NAC组CAT mRNA表达均显著升高(P0.01);与模型组比较,补肾组、NAC组CAT mRNA明显升高(P0.01),抑制剂组与模型组无统计学意义(P0.05);与补肾组、NAC组比较,抑制剂组表达降低(P0.05);补肾组与NAC组之间无统计学意义(P0.05)。结论:1.在体外培养卵母细胞时添加H202会降低PB1排出率,影响卵母细胞减数分裂过程中纺锤体的组装,增加卵母细胞MDA的含量,降低抗氧化酶SOD、GST活性,造成卵母细胞氧化应激损伤。2.补肾调经方及NAC可增加卵母细胞PB1排出率,改善纺锤体组装,降低卵母细胞MDA含量,增加抗氧化酶SOD、GST活性,提高小鼠卵母细胞抗氧化能力,改善卵母细胞质量。3.在氧化应激初期,H2O2、NAC、补肾法均可上调卵母细胞ERK5-Nrf2抗氧化应激信号通路。4.补肾法改善体外培养卵母细胞氧化应激的作用机制可能与其调控ERK5-Keap1-Nrf2抗氧化应激通路相关。且补肾法提高卵母细胞抗氧化能力还可能存在其他蛋白激酶激活Nrf2通路的途径。
【学位授予单位】：河北中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

河北中医学院硕士学位论文各组卵母细胞 CAT m RNA 的表达：正常组为 1.54±0.42，模型±0.33，补肾组为 3.31±0.57；NAC 组为 3.41±0.44，抑制剂±0.36。（Table 4）与正常组比较，模型组、补肾组、NAC 组、抑制剂组表达均显著0.01）；与模型组比较，补肾组、NAC 组 CAT mRNA 明显升高），抑制剂组表达升高（P＜0.05）；与补肾组、NAC 组比较，表达降低（P＜0.05）；补肾组与 NAC 组之间无统计学意义（P＞0g.10）附 图

各组卵母细胞纺锤体形态的比较

【参考文献】

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本文编号：2722398