当归补血汤促骨髓基质细胞黏附机制及其造血功能调控

发布时间：2020-06-21 22:09

【摘要】：目的:研究当归补血汤(DBT)促骨髓基质细胞(BMSCs)粘附作用和迁移能力及其机制;探讨当归补血汤调控造血的能力。方法:一、分别以阿魏酸和芒柄花素作为当归和黄芪的中药标志物,利用中药指纹图谱构建当归补血汤的质量控制标准;二、利用MTT法优化骨髓基质细胞(BMSCs)最佳细胞培养密度和药物使用剂量;根据细胞增殖实验、细胞周期和长期培养实验观察DBT对BMSCs在体外培养的影响。采用粘附实验和迁移实验探索DBT对BMSCs细胞粘附和迁移的作用。免疫荧光染色实验观察黏附蛋白的表达和细胞骨架的改变;三、转录组实验从基因水平分析DBT改变BMSCs细胞内基因表达情况,预测BMSCs粘附作用的机制通路;利用Q-PCR法和Western Blot分别从基因和蛋白角度验证Focal Adhesion通路对BMSCs粘附作用的影响;四、统计DBT处理后悬浮细胞数目反映造血细胞的变化趋势;细胞周期实验是反映造血细胞细胞周期的间接指标;利用流式细胞仪分析造血系细胞中早/中/晚期红系细胞比例;CFU-E实验验证DBT促红系祖细胞向成熟红系分化的能力。结果:分别以阿魏酸和芒柄花素作为当归和黄芪的中药标志物,利用高效液相色谱(HPCL)法分析当归补血汤的色谱图。其中,阿魏酸和芒柄花素的洗脱时间分别是25 min和59 min,同时阿魏酸和芒柄花素分别在323.4 nm和249.9 nm有最大吸收峰,经过比对分析证实当归补血汤中也存在着这两种物质。三次独立样本指纹图谱与实验室以前的对照图谱的相似度达到了97.4%,RSD为1.22%,说明三次独立提取DBT成分从整体的角度基本一致。同一样本不同时间点获得指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.95,RSD为0.67%。说明样品在24h内能保持较好的稳定性。在之前的研究基础下,本实验优化了骨髓基质细胞的培养密度范围为3.2×10~6~4.8×10~6个/mL(1×10~6~1.5×10~6个/cm2)和剂量范围为0.5mg/mL~16 mg/mL。低浓度DBT可以促进BMSCs数目增加,延长了细胞在体外的培养时间,细胞周期出现抑制作用。并且低浓度DBT还可以促进BMSCs细胞黏附和迁移能力。荧光染色结果发现DBT处理组BMSCs黏着斑蛋白表达增多,细胞骨架也明显改变,有明显伪足出现。转录组实验结果预测BMSCs基因差异表达与黏附机制有关,并与Focal Adhesion信号通路相关性最强。Q-PCR和WB实验分别从基因水平和蛋白水平验证了DBT通过激活Focal adhesion信号通路促进黏着斑的表达和细胞骨架蛋白的重排,从而影响BMSCs的粘附和迁移能力。与骨髓细胞共培养36 h,DBT处理组的悬浮细胞数目有下降趋势但无明显差异,细胞周期也无明显影响。当DBT处理30 h时,早期和中期红系细胞的数目和比例显著升高,晚期红系细胞数目和比例显著降低。低浓度的DBT可以促进红系祖细胞的未分化能力增强,但随着浓度的增加红系祖细胞未分化能力减弱。结论:当归补血汤有助于骨髓基质细胞在体外培养,促进细胞增殖,粘附能力和迁移能力。当归补血汤可以通过Focal adhesion信号通路促进骨髓基质细胞表达黏着斑蛋白,促进细胞骨架蛋白重排。当归补血汤可能是通过影响骨髓基质细胞粘附作用间接促进造血祖细胞分化成红细胞。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

光谱图,芒柄花素,当归补血汤,含量测定

广东药科大学硕士研究生学位论文2.3 结果阿魏酸和芒柄花素成分分析为了后期实验的稳定性和可重复性，以当归中的阿魏酸和黄芪中的芒柄花素作为质控的标准，利用高效液相色谱法分析了当归补血汤的图谱。在前人的实验基础上，本实验利用了 Agilent poroshell 120 EC-C18 色谱柱和已经优化过的甲醇-水-冰乙酸流动相，分别获得了阿魏酸、芒柄花素和当归补血汤的全波长扫描图（1A，1C 和 1E）。同时获得该样品在最高可见吸收波长时的光谱图（1B 和 1D）。其中，阿魏酸和芒柄花素的洗脱时间分别是 25min 和 59min，同时阿魏酸和芒柄花素分别在 323.4nm 和 249.9nm 有最高的可见范围内吸收值，经过比对洗脱时间和峰的全波长扫描图，说明当归补血汤中也存在着这两种物质。

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广东药科大学硕士研究生学位论文peak diagram of DBT at 249nm.指纹图谱相似度分析取三次分别提取的 DBT 供试品溶液，连续进样 3 次，考察色谱图相似度、色谱峰保留时间。结果显示，直观观察指纹图谱的整体图形无明显波动。用评价系统（2012A），统计三次独立提取DBT指纹图谱与对照图谱的相似度达到了97.4%，RSD 为 1.22%，说明三次分别提取的 DBT 成分从整体的角度来看基本一致。

【参考文献】