马齿苋酰胺E和马齿苋提取物的神经保护和抗炎活性研究

发布时间：2020-06-22 14:10

【摘要】：马齿苋(Portulaca oleracea L.)为马齿苋科马齿苋属一年生草本植物,属于药食两用中药,具有清热解毒、凉血止血、止痢的功效。现代药理研究表明马齿苋具有抗菌、消炎、止血、抗氧化、抗衰老、耐缺氧、神经保护、降血糖、降血脂等多种作用。如马齿苋提取物对缺氧、鱼藤酮、D-半乳糖/亚硝酸钠和三氯化铝诱导的神经损伤具有保护作用;对耳肿胀、足肿胀、棉棒肉芽肿、溃疡性结肠炎等非特异性炎症、湿疹等变态反应炎症等动物模型、以及脂多糖(LPS)激活的巨噬细胞炎症等模型具有抗炎作用,但其神经保护和抗炎药效物质基础并不十分明确。一、马齿苋酰胺E的神经保护作用研究马齿苋酰胺E(Oleracein E,OE)(8,9-二羟基-1,5,6,10b-四氢-2H-吡咯并[2,1-a]异喹啉-3-酮)为首次从马齿苋中分离得到的具有儿茶酚四氢异喹啉/吡咯烷酮三环骨架的新型生物碱。本课题组前期研究发现OE(15mg/Kg)通过清除自由基、抑制脂质过氧化、缓解氧化应激、抑制神经细胞凋亡、抑制中脑和纹状体ERK磷酸化等途径,对大剂量D-半乳糖/亚硝酸钠诱导的老年痴呆小鼠和鱼藤酮诱导的帕金森病小鼠模型发挥神经保护作用。OE对三氯化铝诱导的老年痴呆动物模型和单纯亚硝酸钠诱导的记忆巩固障碍动物模型是否具有神经保护作用尚未有报道。1.本文利用腹腔注射三氯化铝(40mg/Kg/d)28天建立脑氧化应激和神经毒性昆明小鼠模型,以益智药吡拉西坦(Piracetam,PA)为阳性对照,分别从体重、生存率、认知功能、器官指数、脑组织及血浆铝含量、氧化应激相关生化指标和海马组织形态学及凋亡相关蛋白表达等方面,首次评价了 OE(3 mg/Kg/d和15 mg/Kg/d)灌胃28天对三氯化铝染毒小鼠的神经保护作用。结果表明,三氯化铝引起血和大脑中铝离子含量显著增高(p0.001,p0.01),使血和大脑中氧化应激水平显著升高,如脂质过氧化产物MDA显著增高(p0.001,p0.01),脑中GSH含量代偿性增高(p0.01),并且造成海马神经元细胞的损伤和海马CAI、CA3 和 CA4 区促凋亡蛋白 Caspase-3 的表达升高(p0.001,p0.001,p0.001),以及海马CA1和CA4区促凋亡蛋白Bax的表达升高(p0.01,p0.001),但并未造成小鼠空间学习和记忆能力的显著损伤(p0.05)。紫外分光光度法表明OE可与铝离子形成稳定的螯合物;高剂量OE很可能通过螯合铝离子造成小鼠脑铝含量显著高于模型组(0.01)进而使脑中毒性游离铝的含量降低;OE在高剂量时通过调节SOD、CAT和GSH等氧化应激指标显著降低了 MDA含量(p0.05),缓解了脑中的氧化应激;同时,与阳性对照PA类似,高低剂量OE可以显著抑制三氯化铝导致海马CA4和CA1区的Caspase-3的表达升高(p0.05,p0.001),但对Bax表达无显著影响(p0.05)。以上结果表明,OE作为抗氧化剂、铝螯合剂和凋亡抑制剂,具有缓解三氯化铝导致的小鼠脑内氧化应激和神经毒性的作用。2.本文首次评价了灌胃OE(3 mg/Kg/d和15 mg/Kg/d)56天对腹腔注射亚硝酸钠(90mg/Kg/d)56天染毒昆明小鼠的影响。结果表明,亚硝酸钠染毒可导致小鼠发生死亡,给药第56天,模型组小鼠的生存率仅有70%,PA阳性药物组小鼠的生存率为75%,而OE高剂量组与空白对照组均为85%,OE低剂量组的生存率为90%,各组小鼠生存率无显著性差异(p0.05)。腹腔注射亚硝酸钠造成大脑和血浆脂质过氧化产物MDA显著增加(p0.001,p0.05),但高铁血红蛋白含量并未发生显著变化(p0.05),虽然引起少量的海马神经元细胞发生损伤,但损伤程度并不严重,而且其学习和记忆功能并未有显著性损伤(p0.05),上述结果表明仅亚硝酸钠(90 mg/Kg/d,56 days)单独腹腔注射给药虽然可以造成大脑产生一定的氧化应激,但尚不能造成老年痴呆小鼠模型。与亚硝酸钠模型组小鼠比较:阳性药物PA虽然显著缓解了脑组织SOD活力的代偿性增高0.05),但未能显著的缓解亚硝酸钠诱导的脑组织MDA含量升高(p0.05);低剂量OE组的脑组织GSH含量显著增加(p0.05),然而高剂量OE对SOD和CAT活力以及GSH含量均未有显著影响(p0.05),但高、低剂量OE均显著降低了脑和血中的MDA水平(p0.01,p0.01;p0.01,p0.001),由于前期实验表明酚性生物碱OE具有很强的体外清除DPPH自由基和ROS的能力,推测OE直接清除脑组织ROS可能与其降低脑脂质过氧化水平密切相关。二、马齿苋提取物及马齿苋酰胺E对脂多糖(LPS)诱导脓毒症小鼠的抗炎活性研究脓毒症是由病原微生物入侵机体感染导致的全身炎症反应综合征。清热解毒中药在拮抗内毒素、减少炎症介质、治疗脓毒症方面发挥着重要作用。利用革兰氏阴性菌细胞壁组分脂多糖LPS(又称内毒素)诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症模型以及脓毒症小鼠模型已成为抗炎药物研究的重要模型。大量研究表明,清热解毒中药马齿苋的提取物可显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎性因子TNF-α、IL-6和NO的过量释放;同时本课题组前期发现OE等四氢异喹啉生物碱可显著抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中NO的过量释放;但马齿苋提取物及其单体化合物对LPS诱导的脓毒症小鼠体内模型是否有抗炎作用尚未有报道。因此,本文通过单剂量腹腔注射LPS(5mg/Kg)8h建立了脓毒症昆明小鼠模型,并首次分别对灌胃给药马齿苋醇水提取物(PAAs)(250、500、1000和4000mg/Kg)、PAAs所含的总有机酸提取物(Acid)(50、100、400和1000mg/Kg)、以及OE(5、15和45 mg/Kg)的抗炎活性进行了评价。研究结果表明,与空白对照组相比,单剂量腹腔注射LPS会造成昆明小鼠眼睑分泌物增多、精神萎靡、活动减少,并导致血浆NO(p0.001)、TNF-α(p0.001)和IL-6(p0.001)炎性因子水平显著升高,血浆谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)活性升高(p0.001,p0.01)。(1)PAAs在500～4000 mg/Kg时显著抑制脓毒症小鼠血浆NO水平(p0.05),在1000～4000 mg/Kg时显著抑制TNF-α(p0.05)和IL-6(p0.05)含量的升高,与阳性对照地塞米松(5 mg/Kg)的抗炎活性一致。(2)Acid在50～1000 mg/Kg时可剂量依赖性地显著降低脓毒症小鼠血浆NO含量(p0.05),以及IL-6的含量(p0.01),但对iNOS活性无影响(p0.05),在400～1000 mg/Kg时显著抑制脓毒症小鼠血浆TNF-α含量(p0.05),并在100～400 mg/Kg时显著降低血浆AST和ALT活性(p0.05,p0.01;p0.01,,p0.001),缓解了脓毒症小鼠的急性炎症反应。利用气质联用法对Acid的甲酯化产物进行分析,初步确定了Acid所含的8个主要成分,分别为丁二酸、苯甲酸、苹果酸、柠檬酸、4-羟基肉桂酸、阿魏酸、二十酸和二十一酸。(3)OE在15～45 mg/Kg时可以显著抑制脓毒症小鼠血浆NO过量释放(p0.01),但对脓毒症小鼠血浆中TNF-α和IL-6含量无显著影响(p0.05)。考虑到体外实验发现PAAs、Acid和OE对NO2-有较强的直接清除作用,推测这可能与其显著抑制脓毒症小鼠NO过度释放密切相关。上述研究结果表明总有机酸是马齿苋缓解LPS诱导的脓毒症小鼠急性炎症反应的有效部位,但以OE为代表的四氢异喹啉生物碱是否是清热解毒中药马齿苋中的抗炎活性成分仍有待深入评价和确证。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】