石斛中生物碱分离纯化及神经保护作用研究

发布时间：2020-06-22 21:50

【摘要】：生物碱是石斛属植物中主要活性成分之一,现代药理学研究表明,石斛生物碱具有改善大脑记忆和认知功能障碍的活性。霍山石斛是安徽省道地药材、石斛类中国地理标志保护产品。目前对霍山石斛生物碱的研究主要停留在总生物碱含量检测层面,开展霍山石斛生物碱组成分析及其神经保护作用研究对于其保健功效开发具有重要指导意义。因此,本研究以霍山石斛鲜条为原料,采用加热浸提、液液萃取、固相萃取纯化得到三种霍山石斛生物碱(分别命名为DHALE、DHALSE-2和DHALSE-3),借助HPLC-DAD、GC-MS及LC-QTOF-MS/MS对霍山石斛生物碱样品的组成成分进行分析,最后研究其对氧化损伤神经细胞的预保护作用。主要研究结果如下:(1)霍山石斛总生物碱提取的最佳溶剂为酸性乙醇(70%EtOH,pH=3)。当石斛冻干粉与酸性乙醇料液比1:25,80℃水浴浸提3次,每次2 h,提取得到的总生物碱含量为0.0371%(以冻干粉计),比95%乙醇提取者增加41.06%,相对三氯甲烷提取则提高了508.19%。(2)酸水碱化液液萃取方法可对霍山石斛酸性乙醇提取液中生物碱进行有效富集及初步纯化,且三种提取溶剂所得霍山石斛总生物碱组成成分类似。HPLC-DAD分析表明:经过液液萃取后,石斛生物碱提取物液相色谱图中0-7min中的基质干扰峰可显著减弱;GC-MS分析表明:液液萃取可除去石斛提取液中糖类、醚类和醇类等物质;HPLC-DAD及GC-MS分析证实三种溶剂(酸性乙醇、95%乙醇和三氯甲烷)提取的霍山石斛生物碱组成成分类似。(3)与铁皮石斛或金钗石斛生物碱组成相比,霍山石斛生物碱组成具有特异性。使用HPLC-DAD对霍山石斛总生物碱提取物(DHALE)、金钗石斛总生物碱提取物(DNALE)和铁皮石斛总生物碱提取物(DOALE)进行检测,通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统对其高效液相色谱图进行分析。结果表明:金钗石斛、铁皮石斛与霍山石斛的生物碱组成相似度的相关系数分别为0.564和0.435,此结果说明霍山石斛生物碱组成成分与金钗石斛和铁皮石斛相似度较低,霍山石斛具有自己的特有生物碱组成体系使用GC-MS对DHALE、DNALE和DOALE的检测表明:霍山石斛生物碱有一种特征型生物碱为6-羟基石斛次碱,通过峰面积归一化法计算其相对含量为58.15%。(4)霍山石斛提取物经过液液萃取和固相萃取纯化后,得到样品DHALSE-2和DHALSE-3,LC-QTOF-MS/MS定性分析表明其主要含有6种生物碱类化合物。以PCX为吸附剂的固相萃取柱对霍山石斛生物碱提取物进行分离纯化时,使用含有3%氨水的1:1甲醇/乙腈溶液为洗脱液,即可将霍山石斛生物碱完全洗脱,分别得到DHALSE-2和DHALSE-3。DHALSE-3中生物碱化合物分别为6-羟基石斛次碱(6-hydroxynobiline)、2-羟基石斛碱(2-hydroxydendrobine)、findlayine C、石斛碱(dendrobine)、石斛酮碱(nobilonine)和trans-dendrochrysanine;DHALSE-2中生物碱类分别为6-羟基石斛次碱,石斛酮碱和trans-dendrochrysanine。(5)DHALE、DHALSE-2和DHALSE-3对经H_2O_2诱导氧化损伤的PC12细胞均有预保护作用,DHALSE-3的预保护效果优于DHALE和DHALSE-2。
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285;TQ464
【图文】：

霍山石斛生物碱提取溶剂的筛选，提高霍山石斛总生物碱含量，这对霍山物碱后续分离纯化研究具有重要意义。目前市场上仅有石斛碱一种石斛类生物碱标准品，直接对霍山石斛生物分析存在一定的难度。为此，本研究在采用 HPLC-DAD 和 GC-MS 技术对斛生物碱进行组成分析时，以生物碱含量最高的金钗石斛、拟列入药食同皮石斛生物碱组成作为参照，初步判断霍山石斛生物碱组成的种属特征性。 材料与仪器.1 主要原料原料：霍山石斛鲜条：三年生，安徽霍山县长冲中药材开发有限公司， cm，直径 0.3-0.7 cm；铁皮石斛鲜条：三年生，安徽霍山县长冲中药材开公司，茎长 15-20 cm，直径 0.5-0.8 cm；金钗石斛鲜条：三年生，购于贵州市旺龙镇云集种植基地茎长茎长 35-45 cm，直径 0.5-1.8 cm。将石斛切成段于-80℃下冷冻 24 h 后，真空冷冻干燥 24 h，使用中药粉碎机粉碎，过 100 石斛鲜条冻干粉。三种石斛鲜条形态如图 2.1 所示。

表 2.2 试验仪器与设备（续）Tab 2.2 Test equipment and instruments名称 型号 生产厂商 pH 计 PB-10 德国 Sartorius 公司干燥机 FD - 2 北京博医康试验仪器有限合仪 XW-80A 上海皓庄仪器有限公司光度计 UV - 2600 上海美谱达仪器有限公色谱仪 Agilent 1260 美国安捷伦公司质联用仪 /SCION SQ 美国布鲁克公司设计与试验方法方案设计

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 张淑香;田伟;任燕冬;王萌影;刘树民;;中医药在神经退行性疾病中的应用及研究近况[J];中医药学报;2015年04期

2 李启艳;朱日然;孙萍;姜国萍;;HPLC-DAD法检测染红中药材中20种非法添加色素[J];医药导报;2015年05期

3 陈乃东;李俊;金晖;陈琼;朱庆杰;;HPLC-UV-CL联用研究霍山石斛生物碱清除自由基活性[J];食品工业科技;2015年07期

4 曹玲;王连芝;;气相色谱法在中药分析中的应用[J];黑龙江科技信息;2014年30期

5 陈存武;陈乃东;孟云飞;张艳;胡建;;沉淀敲出法快速发现霍山产铁皮石斛生物碱及其组分抗氧化活性在线测定[J];天然产物研究与开发;2014年07期

6 陈乃东;高峰;林欣;金晖;;不同种源霍山石斛生物碱比较研究[J];中药材;2014年06期

7 徐云燕;王令仪;黄彬;谢笑龙;吴芹;石京山;;不同生长期金钗石斛和铁皮石斛中总生物碱及多糖的比较[J];华西药学杂志;2014年03期

8 杨莉;袁丁;代艳文;狄国杰;张长城;刘朝奇;王婷;;竹节参总提物对H_2O_2诱导SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用[J];第三军医大学学报;2014年02期

9 韦练;郭力;陈佳江;许莉;石媛慧;郝普彦;罗方利;张廷模;韩瑜;;3,5-二硝基水杨酸法测定石斛多糖含量的研究[J];时珍国医国药;2013年06期

10 付小梅;彭水梅;罗光明;吴志瑰;裴建国;孙艳朝;;气相色谱法新进展及其在中药研究中的运用[J];中国现代中药;2013年03期

相关博士学位论文 前2条

1 陆云南;米诺环素通过抑制NLRP3炎症小体激活保护缺血性脑损伤的作用研究[D];苏州大学;2017年

2 李加梅;滋阴中药活性成分对神经退行性疾病的神经保护作用及机制研究[D];上海交通大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 田梦梦;基于LC-MS/MS的分子网络可视化分析六大类茶样中的黄烷醇类生物碱[D];安徽农业大学;2018年

2 张鑫;蛇足石杉内生真菌的分离鉴定及菌株Cercospora lagenariae化学成分研究[D];北京中医药大学;2018年

3 杨晓燕;一氧化碳中毒后迟发性脑病细胞因子的表达及临床治疗分析[D];南昌大学;2018年

4 赵琳;乌药中挥发油及生物碱成分的分离分析方法研究[D];浙江工商大学;2018年

5 冯玛静;亚甲基蓝在实验性大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的抗凋亡作用研究[D];浙江大学;2017年

6 柳源;金钗石斛总生物碱对Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及机制研究[D];遵义医学院;2017年

7 傅桂蓉;脑心通胶囊对高原青年定量负荷运动能力的影响[D];新疆医科大学;2017年

8 柴文静;维生素C后处理对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的影响[D];河北医科大学;2016年

9 刘瑞婷;基于近红外光谱技术的石斛属植物快速鉴别研究与应用[D];浙江农林大学;2015年

10 王亚芸;石斛生物碱提取及其抑制Caco-2活性的研究[D];北京林业大学;2015年

本文编号：2726292