南蛇藤提取物通过Prohibitin抑制人胃癌MGC-803细胞侵袭转移的机制研究

发布时间：2020-06-23 00:27

【摘要】：胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,死亡率位居全球第2位。在中国,2015年胃癌的发病率为15.8%,死亡率为17.6%,在癌症发病顺位中排第二。早期胃癌患者预后较好,且根治性手术治疗疗效显著,其术后5年生存率在85-90%之间[21,但胃癌早期检出率较低,中国胃癌患者中超过75%确诊时已进展至中晚期阶段。目前临床上胃癌的治疗方法不多,单纯手术治疗患者的总体生存率仅19%左右,疗效不佳。此外,放、化疗虽为治疗恶性肿瘤的一个重要手段,但其副作用较大,多应用于术前或术后的辅助性治疗或姑息性治疗。早期侵袭转移是胃癌患者死亡的重要原因,同时肿瘤的侵袭转移机制十分复杂。这一过程主要包括细胞粘附分子(CAM)、细胞外基质(ECM)的变化、上皮间质转化和肿瘤血管生成等,并受多种多样的因素调控。研究表明,抗增殖蛋白(Prohibitin,PHB)是一种进化上高度保守的蛋白,在调节细胞能量代谢、增殖凋亡、核转录中发挥了重要功能。在多种恶性肿瘤中存在PHB的异常表达,有研究发现PHB与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关。南蛇藤(Celastrus Orbiculatus Thunb)系卫矛科南蛇藤属植物,又名过山风、黄藤等,其藤茎、根、叶、果实、种子均可入药,有祛风除湿、行气活血、消肿止痛、解毒等功效。南蛇藤乙酸乙醋提取物(Celastrus Orbiculatus ethylacetate extract,COE)抗肿瘤活性较强。近年体内、外相关实验研究发现,COE能够抑制肿瘤细胞的增殖、诱导细胞调亡自噬、抑制血管生成、抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力等,进而抑制多种肿瘤细胞的生长及转移。本课题组前期研究发现,COE能够明显抑制胃癌细胞的侵袭、转移和EMT的发生,并通过蛋白质组学技术筛选出其靶点蛋白,PHB为其4个差异蛋白点之一。因此,本研究通过RNAi技术获得人胃癌MGC-803/PHB-细胞株,同时观察PHB低表达及不同浓度的COE作用后肿瘤细胞侵袭迁移能力的改变,并探索其作用机制。结果表明,COE通过调控PHB来抑制胃癌细胞的侵袭转移,其机制可能与c-Raf/ERK信号通路有关。本课题研究内容共分为三个部分。(一)南蛇藤提取物对人胃癌MGC-803细胞中PHB表达水平的影响目的:研究不同浓度南蛇藤提取物(COE)对人胃癌MGC-803细胞中PHB表达水平表达水平的影响。方法:对数期人胃癌MGC-803细胞,分别设置阴性对照组、不同浓度(10,20,40μg/mL)COE加药组、阳性对照组(5-fu 32 μg/mL、JLC 0.4 mg/mL)。药物处理细胞24 h后,收集并提取细胞的总蛋白,通过蛋白质印迹法测定细胞中PHB蛋白的表达情况。结果:COE作用MGC-803细胞24 h后,随药物浓度的增加,PHB表达水平逐渐降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论:COE抑制人胃癌MGC-803细胞中PHB的表达水平。(二)人胃癌MGC-803/PHB-细胞株的构建及PHB低表达对MGC-803细胞侵袭转移的影响目的:构建PHB低表达人胃癌MGC-803细胞株,观察PHB低表达对MGC-803细胞侵袭转移的影响。方法:体外培养人胃癌MGC-803细胞至对数期,利用RNAi技术,将LV-PHB-RNAi基因整合入MGC-803细胞DNA,使人胃癌细胞MGC-803中PHB低表达,同时设立野生型细胞组及阴性对照组。转染24h后,倒置荧光显微镜下观察感染后细胞的荧光强度,收集并提取细胞总蛋白,Western blot法检测细胞中PHB蛋白的表达。同时,Transwell细胞侵袭实验测定PHB低表达后,MGC-803细胞侵袭能力的改变。Transwell迁移实验和细胞划痕实验,检测PHB低表达对人胃癌MGC-803迁移能力的影响。同时,Western blot法检测PHB低表达后细胞中侵袭转移相关分子(包括E-cadherin、Vimentin、N-cadherin),基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)及c-Raf/ERK信号通路相关蛋白的表达水平。结果:慢病毒转染24h后,倒置荧光显微镜下,人胃癌MGC-803细胞发出明显的绿色荧光。Western blot结果发现,对比于野生型细胞Control组及空质粒Vehicle组,转染LV-PHB-RNAi细胞组中PHB蛋白表达水平明显下降。PHB低表达能够降低人胃癌MGC-803细胞侵袭迁移能力。同时,PHB低表达后,间质标志物N-cadherin、Vimentin,基质金属蛋白(MMP2、MMP9)及c-Raf、ERK1/2、p-ERKl/2表达水平降低,上皮标志物E-cadherin表达水平增加。结论:成功构建人胃癌MGC-803/PHB-细胞株。PHB低表达抑制人胃癌MGC-803细胞的侵袭迁移能力,其机制可能与c-Raf/ERK信号通路有关。(三)南蛇藤提取物对人胃癌MGC-803/PHB-细胞侵袭转移的影响目的:探讨南蛇藤提取物COE对人胃癌MGC-803/PHB-细胞侵袭转移的影响。方法:对数期人胃癌MGC-803/PHB-细胞,分为阴性对照组(MGC-803/PHB-细胞,不加药),不同浓度 COE 组(10,10,20,40,160,320μg/mL)和阳性对照组(5-fu32μg/mL、JLC0.4mg/mL)。MTT比色法观察药物作用后MGC-803/PHB-细胞增殖抑制的影响,并确定下一步COE药物实验浓度。Transwell细胞侵袭实验观察药物作用对细胞侵袭能力的改变。Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验,观察药物作用后细胞迁移能力的影响。药物作用24 h后,Western blot法检测不同浓度COE作用后,人胃癌MGC-803/PHB-细胞中EMT相关分子(包括 E-cadherin、Vimentin、N-cadherin),基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)及c-Raf/ERK信号通路相关蛋白(c-Raf、ERK1/2、p-ERKl/2)的表达变化。结果:药物作用细胞24h、48h、72h后,人胃癌MGC-803/PHB-细胞的生长受到不同程度的抑制,且具有一定的时间、剂量的依赖性。同时,确定COE非细胞毒性的浓度梯度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL,进行后续实验。药物作用24h后,与阴性对照组对比,人胃癌MGC-803/PHB-的侵袭迁移能力下降。同时,COE降低Vimentin、N-cadherin、MMP2、MMP9、c-Raf、ERK1/2蛋白的表达水平,呈浓度依赖性;随着COE浓度的增加,E-cadherin、p-ERKl/2蛋白的表达水平上升。结论:COE抑制人胃癌细胞MGC-803/PHB-细胞的增殖和侵袭迁移能力,其机制可能与c-Raf/ERK信号通路有关。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

分析图,细胞,人胃癌,表达水平

分析图像。逡逑２．邋４统计学处理逡逑以上实验均己重复３次或以上，数据统计后以平均数±标准差（知Ｓ）表示。以ＳＰＳＳ邋２０．０逡逑分析数据，单因素的比较用？检验，多均数的采用方差分析（ＡＮ０ＶＡ），＊，Ｐ＜０．０５表示逡逑有统计学意义，＊＊，邋Ｐ＜０．０１表示有显著统计学意义。逡逑３结果逡逑３．１南蛇藤提取物对人胃癌ＭＧＣ－８０３细胞中ＰＨＢ表达水平的影响逡逑浓度１０，２０，邋４０邋｜ａｇ／ｍＬ的ＣＯＥ作用于人胃癌ＭＧＣ－８０３细胞２４邋ｈ后，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ方逡逑法检测ＰＨＢ蛋白的表达。结果发现，同阴性对照组对比，随着ＣＯＥ浓度的增加，ＣＯＥ处逡逑理组中ＰＨＢ表达水平逐渐降低，阳性对照组５－ｆｕ与高浓度ＣＯＥ作用相似。表明ＣＯＥ能逡逑够抑制人胃癌ＭＧＣ－８０３细胞中ＰＨＢ的表达水平，具有一定浓度依赖性。逡逑＾邋１５０－逡逑

慢病毒感染,慢病毒,转染,荧光

３．１倒置荧光显微镜观察慢病毒感染细胞的荧光表达逡逑慢病毒转染７２ｈ后，倒置荧光显微镜观察细胞的荧光表达，以带有绿色荧光蛋白的空逡逑质粒Ｖｅｈｉｃｌｅ组作为阴性对照组，结果如图２所示，慢病毒ＬＶ－ＰＨＢ－ＲＮＡｉ处理组细胞能观逡逑察到较强的荧光表达。逡逑Ｐｈａｓｅ逦ＧＦＰ逦Ｍｅｒｇｅ逡逑图２．慢病毒感染后的细胞荧光表达（１０0ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｇｒｅｅｎ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｂｅｆｏｒｅ邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ邋（１０0ｘ邋）逡逑３．２转染后ＭＧＣ－８０３细胞中ＰＨＢ蛋白的表达逡逑慢病毒ＬＶ－ＰＨＢ－ＲＮＡｉ转染后，通过Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔ检测细胞内ＰＨＢ的表达水平。对比逡逑野生型细胞Ｃｏｎｔｒｏ丨组及空质粒Ｖｅｈｉｃｌｅ组，ＬＶ－ＰＨＢ－ＲＮＡｉ转染组细胞中ＰＨＢ的表达水平逡逑明显下降，如阁３所示。提示己成功获得人肖癌ＭＧＣ－８０３／ＰＨＢｌｍ胞株。逡逑１５０１逡逑！逡逑／，／邋ｒ＿ｎ邋ｎ逡逑ＰＨＢ邋—邋＿邋＾３２ｋＤａ邋ｆ５０＇逦“逡逑Ｐ－ａｃｔｉｉｉ邋—邋＿丨－逦—．ｍ邋４２ｋＤａ邋＾邋0邋｜｜逡逑＃逡逑图３慢病毒感染后ＰＨＢ蛋白的表徸逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰＨＢ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ａｆｔｅｒ邋ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ邋ｔｒａｎｓｆ

【参考文献】