雷公藤内酯醇减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤及其作用机理的研究

发布时间：2020-06-23 18:54

【摘要】：冠心病已成为高发病率和死亡率的主要疾病之一,其主要致死原因为急性心肌梗死。随着经皮冠状动脉介入治疗、溶栓、血管形成术和冠状动脉搭桥手术等急性心肌梗死治疗方法的发展,由心肌缺血再灌注引起的心肌收缩功能障碍、心肌顿抑、心律失常以及不可逆的心肌细胞损害使缺血再灌注损伤成为了临床研究的重要问题。多项研究表明,进行缺血再灌注同时或再灌注以前,使用药物和心肌保护剂能减轻心肌缺血再灌注损伤,减少心肌梗死面积,对防止心肌缺血再灌注损伤具有重要意义。但目前仍缺乏能够有效治疗心肌缺血再灌注损伤的策略及药物。如何减轻缺血再灌注损伤,提高急性心肌梗死患者的术后生存率仍然是治疗急性心肌梗死急需解决的难题。雷公藤内酯醇(Triptolide,TPL)是从雷公藤的根中提取的二萜内酯,具有抗炎、抗氧化、抗癌等多种功效,其抗炎作可以促进糖尿病性心肌病大鼠心室功能恢复,缓解心肌纤维化,对心脏具有保护作用。此外,TPL对缺血再灌注引起的器官或组织损伤也具有保护作用,TPL能够有效抑制氧化应激和炎性因子表达,降低中性粒细胞浸润,缓解肝脏、肺等器官的缺血再灌注损伤。由于氧化应激和炎症反应与心肌缺血再灌注损伤密切相关,TPL在预防与治疗氧自由基和炎症反应引起的心肌缺血再灌注损伤中是否具有保护作用,目前尚不清楚。因此本研究通过建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,腹腔注射TPL溶液后,探究TPL对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其作用机理,为缺血再灌注损伤的临床治疗奠定理论和实验基础。目的:1、建立大鼠心肌缺血再灌注模型,观察TPL是否对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。2、探究TPL对缺血再灌注损伤大鼠心脏组织炎症反应的影响及其机制。3、探究TPL对缺血再灌注损伤大鼠心脏组织氧化应激的影响及其机制。方法:1、TPL对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用(1)建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型,雄性健康Wistar大鼠随机分为六组:(1)假手术组,(2)假手术与高剂量TPL组(sham+H-TPL group),(3)缺血再灌注损伤模型组(I/R group),(4)I/R与低剂量TPL组(I/R+L-TPL group),(5)I/R与中剂量TPL组(I/R+M-TPL group),(6)I/R与高剂量TPL组(I/R+H-TPL group)。(2)腹腔注射不同剂量(25μg/kg,50μg/kg,100μg/kg)TPL溶液,用飞利浦IE33超声系统进行血流动力学数据采集,包括左心室收缩末期压(LVESP),左心室舒张末期压(LVEDP)及心脏缩短分数(FS)。(3)抽取各组大鼠血液样本,用试剂盒检测血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酶(GOT)活性。(4)HE染色检测各组大鼠心脏组织形态学变化。(5)免疫组化检测各组大鼠心脏组织中巨噬细胞浸润情况。(6)TTC法检测各组大鼠的心肌梗死面积。2、TPL对缺血再灌注损伤大鼠心脏组织炎症反应的影响及其机制(1)建立大鼠心肌缺血再灌注模型,腹腔注射不同剂量(25μg/kg,50μg/kg,100μg/kg)TPL溶液,Real-time PCR检测大鼠心脏组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的m RNA表达情况。(2)ELISA检测大鼠心脏组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。(3)Western blot检测大鼠心脏组织中P38 MAPK、p-P38 MAPK的表达。3、TPL对缺血再灌注损伤大鼠心脏组织氧化应激的影响及其机制(1)建立大鼠心肌缺血再灌注模型,腹腔注射不同剂量(25μg/kg,50μg/kg,100μg/kg)TPL溶液,测定大鼠心脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)、血红素加氧酶1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性以及谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量。(2)Western blot检测大鼠心脏组织细胞质和细胞核中Nrf2的表达。4、统计学分析所有数据均用SPSS16.0软件进行统计处理,观察指标用均数±标准差表示两组间比较采用t检验,p0.05为差异有统计学意义。结果:1、血流动力学数据采集结果显示,高剂量TPL明显降低I/R大鼠LVEDP,增加LVESP和FS(与I/R模型组大鼠比较,p0.05)。2、血清中酶活检测结果表明,与I/R模型组相比,预先腹腔注射高剂量TPL(100μg/kg)能明显降低I/R大鼠血清CK、LDH及GOT活性(p0.01)。3、HE染色显示,高剂量TPL(100μg/kg)I/R大鼠心肌细胞只有少量坏死区域,心肌纤维排列较整齐,心肌细胞间质仅有少量炎性细胞浸润,结构清晰,能够显著改善心脏组织I/R损伤的病理学改变。4、免疫组化结果表明,TPL能够减少心脏组织中巨噬细胞的浸润数量。5、TTC法检测各组大鼠的心肌梗死面积发现,预先腹腔注高剂量TPL(100μg/kg)能明显降低I/R大鼠心肌梗死面积(与I/R模型组大鼠比较,p0.01)。6、Real-time PCR结果显示,与I/R组相比,中、高剂量TPL能显著降低TNF-αm RNA的表达(p0.01)不同剂量TPL均能显著降低IL-1β和IL-6 m RNA的表达(p0.01)。7、ELISA检测结果显示,预先腹腔注射低、中、高剂量TPL均能显著降低I/R大鼠心脏组织TNF-α、IL-1β和IL-6的表达(与I/R模型组大鼠比较,p0.05,p0.01)。8、Western blot检测TPL对I/R大鼠心脏组织中P38、p-P38的表达影响,结果显示,不同剂量TPL均能明显提高p-P38蛋白表达量(与I/R模型组比较,p0.01)。9、腹腔注射中剂量TPL(50μg/kg)能够提高I/R大鼠心脏组织SOD、HO-1和GSH-PX活性(与I/R模型组大鼠比较,p0.05,p0.01),但心脏组织中MDA、GSH含量没有显著改变。与I/R模型组大鼠比较,高剂量TPL(100μg/kg)I/R大鼠心脏组织中SOD、HO-1、GSH-PX活性均明显升高(p0.01),MDA产物明显减少(p0.01),GSH含量明显增多0(p0.01)。10、Western blot检测结果显示,预先腹腔注射低、中、高剂量TPL(25μg/kg,50μg/kg,100μg/kg)I/R大鼠心脏组织细胞核Nrf2表达量明显上调(与I/R组相比,p0.01)。结论:1、高剂量TPL(100μg/kg)可以改善大鼠缺血再灌注后心脏血流动力学紊乱,增强心肌收缩力,促进心脏功能恢复。2、高剂量TPL能明显降低I/R大鼠血清CK、LDH及GOT活性,减轻心肌损伤,显著改善心脏组织I/R损伤的病理学改变,降低心脏组织巨噬细胞浸润数量,明显减少I/R大鼠心肌梗死面积。3、TPL(25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg)可明显抑制I/R大鼠心脏组织TNF-α、IL-1β、IL-6 m RNA和蛋白的表达,有效降低心肌缺血再灌注损伤的炎症反应,TPL对P38 MAPK信号通路的激活与抗心肌缺血再灌注的炎症反应有密切关系。4、高剂量TPL(100μg/kg)可增强I/R大鼠抗氧化能力,明显提高I/R大鼠心脏组织SOD、HO-1、GSH-PX活性,增加GSH含量,降低MDA含量。5、TPL能够激活I/R大鼠心脏组织Nrf2抗氧化应激信号通路,且TPL可能通过激活Nrf2信号通路发挥抗心肌缺血再灌注氧化损伤。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

HE染色,心肌纤维,大鼠心肌细胞,组织常规

PL 对心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏组织病理改变的影响组大鼠经缺血 45 min，再灌注 3 h 后，将各组大鼠心脏组织常规脱图 2，结果显示假手术组大鼠心肌细胞形态学无改变，结构清晰，整齐，呈红色，细胞核为长椭圆形，呈蓝色，心肌细胞间质无炎性剂量 TPL 假手术组染色结果与假手术组相似。I/R 组心肌纤维排列部横纹不清，心肌纤维间隙增宽，可见大量炎性细胞浸润以及出血现大量心肌细胞坏死区域，呈粉白色。 I/R 组相比，TPL 低剂量 I/R 大鼠心肌细胞坏死区域减少，组织出血润减少，但大部分心肌纤维排列紊乱。TPL 中剂量 I/R 大鼠心肌细著减少，心肌纤维排列局部出现紊乱，炎性细胞浸润减少显著减少， I/R 大鼠心肌细胞只有少量坏死区域，心肌纤维排列较整齐，心肌少量炎性细胞浸润，结构清晰。

分布情况,巨噬细胞,分布情况

中国医科大学博士学位论文、TPL 对心肌缺血再灌注损伤大鼠心脏组织中巨噬细胞浸润的影响各组实验大鼠经缺血 45 min，再灌注 3 h 后，用 F4/80 抗体进行免疫组化组大鼠心脏组织中巨噬细胞浸润情况，结果如图 3，心脏组织中巨噬细胞色。假手术组与高剂量 TPL 假手术组大鼠心脏组织中可见少数巨噬细胞，而型组大鼠心脏组织中可见大量巨噬细胞浸润。与 I/R 模型组相比，预先腹腔注射低剂量 TPL 的 I/R 大鼠心脏组织中巨数量有所减少，而中剂量 TPL 的 I/R 大鼠心脏组织中巨噬细胞数量显著减剂量 TPL 的 I/R 大鼠心脏组织中仅有少量巨噬细胞浸润。

【参考文献】