经方“下瘀血汤”对急性放射性肠炎大鼠模型的治疗作用及相关机制研究

发布时间：2020-06-25 06:54

【摘要】：目的:利用放射线诱导建立急性放射性肠炎(Acute Radiation Enteritis ARE)大鼠模型,观察经方“下瘀血汤”对ARE大鼠模型的治疗作用,初步探讨其作用机理,并基于此研究上分析“下瘀血汤”的组成成分,进一步探讨其有效组分大黄酸对ARE大鼠模型的治疗作用及相关分子机制,为临床应用经方“下瘀血汤”及其有效组分治疗ARE提供理论及实验依据。方法:将30只雄性大鼠随机分为3组,A组即正常对照组(n=10);B组即生理盐水对照组(n=10);C组即下瘀血汤组(n=10)。B组、C组以高能医用X射线I0Gy单次局部照射建立急性放射性肠炎大鼠模型。从照射后第1日开始,除正常对照组,B组、C组分别以生理盐水及下瘀血汤对其进行干预,连续灌胃7天,每日观察大鼠体质量衰减百分率、粪便性状、便血、自主活动等一般情况。用HE染色法观察大鼠模型回肠和结肠的组织病理学变化;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠模型血清中炎性相关因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-αα)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素(IL-6)水平;免疫组化实验测定大鼠模型肠道组织中相关炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6的表达。通过高效液相色谱法(HPLC)分析下瘀血汤中有效成分及含量测定。确定主要组分后,选取“下瘀血汤”中有效成分大黄酸并进一步探讨其对急性放射性肠炎大鼠模型的治疗作用,将50只雄性大鼠随机分为5组,分别为A组正常对照组(n=10);B组生理盐水对照组(n=10);C组大黄酸组(n=30),C组又分 C1:大黄酸(9ug/100g)组(n=10)、C2:大黄酸(18ug/100g)组(n=10)及 C3:大黄酸(36ug/100g)组(n=10)。用同样的方法造模型及给药,进行疾病活动度指数(DAI)评分,HE染色法观察大鼠模型回肠和结肠的组织病理学变化;免疫组化实验测定大鼠模型肠道组织中相关炎性因子TNF-α、IL-1、IL-6的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠模型血清中一氧化碳(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量;western-blot检测大鼠模型肠道组织中PPAR-γ、NF-kB的表达。结果:1、本实验利用医用X射线直线加速器照射大鼠腹部,成功建立急性放射性肠炎大鼠模型。2、造模成功后,与正常对照组相比较,各照射组大鼠均出现不同程度的体质量、粪便性状及自主活动的改变,下瘀血汤治疗组一般情况及排便情况较生理盐水组好。3、HE染色法观察大鼠模型回肠和结肠的组织病理学变化,照射后下瘀血汤治疗组大鼠模型回肠与结肠肠粘膜基本完整,炎症较轻;而生理盐水组大鼠模型肠道组织出现粘膜坏死、脱落、腺体萎缩,炎症反应重等情况。4、酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠模型血清中炎症相关因子水平,结果显示下瘀血汤治疗组与生理盐水组相比,血清中TNF-α的含量显著降低,有统计学意义(P0.01)。IL-1及IL-6的含量降低则更为显著(P0.01)。5、免疫组化实验测定大鼠模型肠道中炎症相关因子水平,结果显示下瘀血汤治疗组与生理盐水组相比,在大鼠模型回肠组织中TNF-α阳性率显著降低(P0.01);IL-1阳性率有显著性差异(P0.05);IL-6阳性率有显著性差异(P0.05)。下瘀血汤治疗组与生理盐水组相比,在大鼠模型结肠组织中TNF-α 阳性率显著降低(P0.01);IL-1阳性率有显著性差异(P0.01);IL-6阳性率有显著性差异(P0.05),均有统计学差异。6、“下瘀血汤”中含有以下成分:苦杏仁苷、尿嘧啶、大黄酸和大黄素。7、造模成功后,与正常对照组相比较,各照射组大鼠均出现不同程度的体质量、粪便性状及自主活动的改变,大黄酸治疗组一般情况及排便情况较生理盐水组好。8、HE染色法观察大鼠模型回肠和结肠的组织病理学变化,照射后生理盐水组大鼠模型肠组织出现粘膜破坏,绒毛剥脱和隐窝萎缩;大黄酸治疗组大鼠模型肠组织绒毛及肠粘膜的凝固性坏死较少,炎症较轻。大黄酸治疗组三个亚组(C1、C2、C3)中,C2组的肠损伤较C1组轻(P0.05),C3组的肠损伤又较C2组轻(P0.05),均有统计学差异。9、酶联免疫吸附试验(ELISA)测定大鼠模型血清中NO、SOD、GSH和MDA的含量,实验结果显示,与正常对照组相比较,各照射组大鼠模型血清中NO和MDA升高(P0.01),SOD和GSH活性降低(P0.01),大黄酸治疗组大鼠模型血清中的NO和MDA含量较生理盐水组显著降低(P0.01),而SOD和GSH活性较生理盐水组高(P0.01)。大黄酸治疗组的三个亚组(C1、C2、C3)中,C3组的NO和MDA含量较C1、C2组低(P0.01),SOD和GSH活性较C1、C2组高(P0.01),均有统计学差异。10、免疫组化实验测定大鼠肠道中炎症相关因子水平,结果显示,与正常对照组相比较,各照射组大鼠模型肠道组织中TNF-α、IL-1、IL-6的表达均升高(P0.05),且生理盐水组大鼠模型肠道组织中的TNF-α、IL-1、IL-6的表达明显高于大黄酸治疗组(P0.05),大黄酸治疗组的三个亚组(C1、C2、C3)中,C3组肠道中的TNF-α、IL-1、IL-6的表达较C1、C2组低(P0.05),C1、C2组肠道组织的TN F-α、IL-1、IL-6的表达对比无明显异常(P0.05),均有统计学意义。11、通过western-blot检测大鼠模型肠道组织中PPAR-γ/NF-kB的表达,实验结果显示,与正常对照组相比较,各照射组大鼠PPAR-γ的表达显著降低(P0.01),大黄酸治疗组的PPAR-γ的表达明显高于NS组(P0.01),大黄酸治疗组的三个亚组中,组间差异无明显统计学意义(P0.05)。相反,各照射组大鼠的NF-kB的表达显著升高(P0.01),大黄酸治疗组的NF-kB的表达明显低于NS组(P0.01),大黄酸治疗组的三个亚组中,随着大黄酸浓度的升高,NF-kB的表达降低(P0.01)。结论:1、“下瘀血汤”可以有效的减轻急性放射性肠炎大鼠模型的症状,如消瘦、腹泻、便血等。2、“下瘀血汤”对急性放射性肠炎大鼠模型的肠粘膜具有保护作用,能够有效的降低大鼠血清及肠道组织中炎症相关因子TNF-α、IL-1和IL-6的浓度。3、初步判定“下瘀血汤”中含有以下成分:大黄酸、苦杏仁苷、尿嘧啶和大黄素。4、“下瘀血汤”中有效成分大黄酸可以有效减轻急性放射性肠炎大鼠模型的症状,如消瘦、腹泻、便血等。5、“下瘀血汤”中有效成分大黄酸能够降低大鼠模型肠道组织中炎症相关因子TNF-α、IL-1和IL-6的浓度而发挥对急性放射性肠炎的抗炎作用。6、“下瘀血汤”中有效成分大黄酸能够通过提高大鼠模型血清中SOD和GSH的含量及降低NO和MDA的表达从而达到对急性放射性肠炎的抗氧化损伤作用。7、“下瘀血汤”中有效成分大黄酸有效治疗急性放射性肠炎的作用机理与PPAR-γ/NF-kB通路作用有关。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R-332
【图文】：

大鼠模型,形态组织学,结肠,体重变化

粘膜层凝固性坏死，Ｃ组大鼠模型肠道组织无明显炎性细胞浸润，小部分回肠粘膜层至肌逡逑层凝固性坏死；Ｂ组大鼠模型结肠组织可见局部上皮细胞脱落坏死，Ｃ组大鼠模型结肠粘逡逑膜基本正常（图１－３）。逡逑正常组逦生押盐水组逦下Ｗｆｌｌ汤绀逡逑：：；丨逡逑图１－３放射性肠炎大鼠模型回肠及结肠组织的病理改变逡逑４．邋３酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）检测放射性肠炎大鼠血清中ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－１、ＩＬ－６的含量逡逑处死后大鼠用ＥＬＳＩＡ法检测血清中ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｌ、ＩＬ－６含量，结果如（（表１－２，阁１－４）逡逑所示，Ｃ组与Ｂ组相比，大鼠模型血清中ＴＮＦ－ａ的含量显著降低，有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。逡逑９逡逑

放射性肠炎,大鼠模型,酶联免疫法,病理改变

逦丁逡逑■ｇｉｌｌ逡逑图１－３大鼠模型的体重变化逡逑４．邋２大鼠模型回肠及结肠形态组织学改变逡逑处死后将各组大鼠的回肠及结肠组织在光镜下观察，发现Ｂ组大鼠回肠粘膜层有较多逡逑淋巴细胞、浆细胞和少量中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润，大部分绒毛上皮糜烂，绒毛和逡逑粘膜层凝固性坏死，Ｃ组大鼠模型肠道组织无明显炎性细胞浸润，小部分回肠粘膜层至肌逡逑层凝固性坏死；Ｂ组大鼠模型结肠组织可见局部上皮细胞脱落坏死，Ｃ组大鼠模型结肠粘逡逑膜基本正常（图１－３）。逡逑正常组逦生押盐水组逦下Ｗｆｌｌ汤绀逡逑：：；丨逡逑图１－３放射性肠炎大鼠模型回肠及结肠组织的病理改变逡逑４．邋３酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）检测放射性肠炎大鼠血清中ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－１、ＩＬ－６的含量逡逑处死后大鼠用ＥＬＳＩＡ法检测血清中ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－ｌ、ＩＬ－６含量，结果如（（表１－２，阁１－４）逡逑所示，Ｃ组与Ｂ组相比，大鼠模型血清中ＴＮＦ－ａ的含量显著降低，有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。逡逑９逡逑

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