自噬降低外源性MTDs诱导肺泡巨噬细胞炎症反应的机制研究

发布时间：2020-06-25 04:48

【摘要】：目的:观察外源性线粒体损伤相关分子模式(MTDs)对肺泡巨噬细胞(AM)的致炎作用,以及自噬对MTDs诱导的炎症反应的影响,初步探讨自噬调控MTDs致炎作用的分子机制。方法:提取SD大鼠肝脏组织MTDs,采用Janus Green B进行线粒体染色;体外培养NR8383细胞,分别予non-MTDs、MTDs、LPS+Nigericin、RAPA+MTDs、3-MA+MTDs、MCCC950、MCCC950+MTDs处理,采用ELISA检测细胞上清液中的炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-18含量,采用Western Blot检测细胞中NLRP3、ASC、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β的表达和上清液中成熟caspase-1、IL-1β含量,采用免疫荧光检测细胞中LC3标记自噬小体和ASC聚合体形成,采用透射电子显微镜检测自噬小体形成,采用RT-qPCR检测细胞中NLRP3、ASC和caspase-1mRNA的表达。结果:1、Janus Green B染色显示成功富集线粒体;MTDs刺激AM后,上清液中TNF-α、IL-1β和IL-18含量较control组或non-MTDs处理组显著升高,细胞中NLRP3、ASC和Pro-caspase-1蛋白表达增多。2、RAPA预处理AM后予以MTDs刺激,自噬小体较control组或单纯MTDs组增多,3-MA预处理AM后未见自噬小体;与MTDs组相比,RAPA+MTDs组上清液中IL-1β和IL-18含量减少,TNF-α含量无明显变化,3-MA+MTDs组上清液中TNF-α、IL-1β和IL-18含量变化无显著差异。3、RAPA或3-MA预处理的AM予以MTDs刺激,与MTDs组相比,RAPA+MTDs组上清液中成熟caspase-1和IL-1β含量,以及细胞中ASC聚合体、NLRP3、ASC和Pro-caspase-1蛋白表达均显著减少,相反,3-MA+MTDs组均无显著差异;但是RAPA和3-MA预处理对MTDs诱导AM细胞中Pro-IL-1β蛋白和NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA表达均无显著影响。4、MCC950预处理AM后予以MTDs刺激,与MTDs组相比,MCC950组细胞上清液中IL-1β和IL-18含量明显降低,成熟caspase-1和IL-1β含量显著减少,细胞中ASC聚合体形成减少,但是上清液中TNF-α含量以及细胞中Pro-caspase-1和Pro-IL-1β蛋白表达无显著改变。结论:外源性MTDs可以诱导大鼠AM炎症因子分泌和NLRP3炎性体相关蛋白表达,诱导自噬可以减轻MTDs诱导的炎症反应,初步分析其机制主要是自噬降低MTDs活化的NLRP3炎性体的稳定性,促进其降解,减少caspase-1活化,抑制炎性体特异性炎症因子IL-1β和IL-18成熟和分泌。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

第 1 章 引言器给溶酶体，进行降解，以利于细胞重新利用的过程，因此自噬被认为是一种胞内物质循环再利用的机制[33]。Saitoh 等[34]敲除 ATG16L1，抑制自噬小体形成，降低自噬相关的降解，增强巨噬细胞 caspase-1 活化，促进炎症因子 IL-1β 和 IL-18成熟和分泌，增强内毒素诱导小鼠的炎症反应。而敲除自噬相关基因或 3-MA 处理抑制自噬可增强 NLRP3 炎性体活化，促进炎症因子分泌，促进中性粒细胞浸润，增加脓毒症死亡率[35,36]。相反，自噬诱导剂可以抑制 NLRP3 炎性体活化，减轻 DAMP 诱导的炎症反应[37,38]。这些研究表明，自噬可抑制 NLRP3 炎性体活化，减少炎性体特异性炎症因子的分泌，改善炎性体相关疾病，但自噬对 MTDs诱导的 NLRP3 炎性体活化的调控作用仍未见报道，基于以上研究推测，自噬可能通过减少 MTDs 诱导的 NLRP3 炎性体活化，减轻 AM 炎症反应，从而改善创伤后 ARDS（图 1-1）。

第 3 章 结果第 3 章 结果3.1 MTDs 诱导 AM 炎症反应3.1.1 线粒体 Janus Green B 染色提取线粒体后，采用 Janus Green B 对线粒体进行染色观察。线粒体经 JanusGreen B 染色后，内膜呈蓝绿色，线粒体悬液光镜下可见大量蓝绿色线粒体，而去线粒体上清中，只看到极少量蓝绿色的线粒体（图 3-1），提示成功获得高浓度线粒体。

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本文编号：2728880