【摘要】：目的:本研究应用脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)构建炎症模型,利用分子生物学、细胞生物学等研究方法,从体外实验验证模型细胞炎症反应与5-HT信号通路相关性,同时观察益气健脾方含药血清对模型细胞炎症反应的调控作用并探讨其机制,进一步丰富从脾论治AS,以期为中医药靶向治疗心血管疾病提供了参考和借鉴。材料与方法:1.血清的制备24只SPF级雄性8周龄SD大鼠,随机分为4组:正常组、模型组、益气健脾方组和阿托伐他汀组,正常组与模型组用生理盐水进行灌胃,后两组分别应用益气健脾方、阿托伐他汀灌胃,每日1次,持续7天。在最后一次给药2h后,从腹主动脉取血,离心,收集上清液,合并同组的含药血清,使用0.22μm一次性滤器对其进行无菌过滤,储存在-80℃冰箱中备用。2.益气健脾方对LPS诱导HUVECs炎症反应的作用体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),随机分为4组:正常组、模型组、益气健脾方组和阿托伐他汀组。除正常组外,其余各组均采用LPS(1.5μg/ml)刺激HUVECs24h,同时正常组与模型组应用正常血清、治疗组应用相应药物血清分别对相应组的细胞进行干预,并分为三个干预时间点即2h、4h、8h(分别在22h、20h、16h加入药物),统一于24h后收集细胞,使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测分析各组细胞因子IL-6、TNF-α、5-HT表达的变化以及不同干预时间对疗效的影响。3.益气健脾方改善LPS诱导HUVECs炎症水平的机制研究体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),随机分为6组:正常组、模型组、拮抗剂组、益气健脾方组、益气健脾方+拮抗剂组及阿托伐他汀组。除正常组外,其余各组均采用LPS(1.5μg/ml)刺激HUVECs 24h,同时分别用正常血清、正常血清+拮抗剂、益气健脾方血清、益气健脾方血清+拮抗剂和阿托伐他汀血清对相应组细胞进行干预8h(在16h后加药),统一于24h后收集细胞。应用蛋白质印迹法(Western-blot)检测PKC、p-PKC、NF-κB蛋白的表达;使用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应法(Real-time PCR)检测PKC、NF-κB的m RNA的表达。结果:1.HUVECs细胞中白细胞介素-6(IL-6)的表达结果与正常组比较,模型组IL-6表达明显升高(P0.05);与模型组比较,益气健脾方组、阿托伐他汀组的IL-6的表达出现下调(P0.05或p0.01)。实验将益气健脾方组分三个时间梯队(2h、4h、8h)对模型细胞进行干预,与模型组比较,从统计学分析8h效果相对最佳。2.HUVECs细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达结果与正常组比较,模型组中TNF-α表达升高(P0.05);与模型组比较,益气健脾方组、阿托伐他汀组的TNF-α的表达出现下调(P0.05或p0.01)。实验将益气健脾方组分三个时间梯队(2h、4h、8h)对模型细胞进行干预,与模型组比较,从统计学分析8h效果相对最佳。8h干预条件下,益气健脾方组与阿托伐他汀组比较,TNF-α表达差异不显著(P0.05)。3.HUVECs细胞中5-羟色胺(5-HT)的表达结果与正常组比较,模型组中5-HT表达升高(P0.05);与模型组比较,益气健脾方组、阿托伐他汀组的5-HT表达出现下降(P0.05或p0.01)。实验将益气健脾方组分三个时间梯队(2h、4h、8h)对模型细胞进行干预,与模型组比较,从统计学分析8h效果相对最佳。8h干预条件下,益气健脾方组与阿托伐他汀组比较,5-HT表达差异不显著(P0.05)。4.HUVECs细胞中蛋白激酶C(PKC)的表达结果与正常组比较,模型组PKC蛋白及m RNA表达量显著升高(P0.01);与模型组比较,拮抗剂组PKC蛋白及m RNA的表达量下降(P0.05),其余各治疗组PKC蛋白及m RNA表达量均明显下降(P0.01);与拮抗剂组比较,益气健脾方组、益气健脾方+拮抗剂组PKC蛋白及m RNA表达量均显著下降(P0.01)。综上,各治疗组相比疗效依次为益气健脾方+拮抗剂组阿托伐他汀组益气健脾方组拮抗剂组。5.HUVECs细胞中磷酸化蛋白激酶C(p-PKC)的表达结果与正常组比较,模型组p-PKC蛋白表达量显著升高(P0.01);与模型组比较,各治疗组p-PKC蛋白表达量均明显下降(P0.01);与拮抗剂组比较,益气健脾方组、益气健脾方+拮抗剂组p-PKC蛋白表达量均显著下降(P0.01)。综上,各治疗组相比疗效依次为益气健脾方+拮抗剂组阿托伐他汀组益气健脾方组拮抗剂组。6.HUVECs细胞中核因子κB(NF-κB)的表达结果与正常组比较,模型组NF-κB蛋白及m RNA表达量显著升高(P0.01);与模型组比较,拮抗剂组NF-κB蛋白及m RNA的表达量下降(P0.01或P0.05),其余各治疗组的NF-κB蛋白及m RNA表达量均明显下降(P0.01);与拮抗剂组比较,益气健脾方组、益气健脾方+拮抗剂组NF-κB蛋白及m RNA表达量均显著下降(P0.01)。综上,疗效依次为益气健脾方+拮抗剂组阿托伐他汀组益气健脾方组拮抗剂组。结论:1.经LPS诱导的HUVECs中出现促炎细胞因子IL-6、TNF-α的上调,同时在各组炎症模型细胞中均发现5-HT的分泌增加,提示5-HT的过度分泌与内皮细胞炎症反应可能是共同促进AS发生发展的机制;2.益气健脾法中药复方(益气健脾方)能够通过5-HT2A受体靶向调控动脉粥样硬化免疫炎症过程,改善炎症因子分泌,抑制5-HT及其下游PKC-NF-κB信号通路活化,这可能是该方干预早期AS的重要机制靶点之一;3.益气健脾方与5-HT2A受体拮抗剂均可改善模型细胞的炎症反应,疗效前者优于后者,提示益气健脾方可能是在进一步拮抗5-HT信号转导通路的基础上,以发挥改善内皮细胞炎症反应的作用,从而干预早期AS的发生发展。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：
论文一技术路线图示
A：正常组；B：模型组；C：阿托伐他汀组；D：益气健脾方组不同时间益气健脾方含药血清对人脐静脉内皮细胞 IL-6 表达的影响（—X** 与正常组比较 P＜0.01；# 与模型组比较 P＜0.05；## 与模型组与阿托伐他汀组比较 P＜0.05。健脾方含药血清对LPS诱导的HUVECs促炎细胞因子TNF-α释放的影常组外，其他各组均使用 LPS 刺激 HUVECs 24h。与正常组比较，模型上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组细胞差异有统计学意义（P＜0.05 或 p＜0.01）。本实验将益气健脾方组分h、4h、8h）并对模型细胞进行干预，结果表明：与阿托伐他汀组比较预 2h、4h 的 TNF-α表达具有统计学差异（P＜0.05），8h 的 TNF-α表＞0.05）；与模型组比较，益气健脾方组干预 8h 比干预 2h、4h 的统计
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本文编号：2728828
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