鞣花酸保护去卵巢小鼠骨丢失的作用及其分子机制研究

发布时间：2020-06-25 12:35

【摘要】：研究背景和目的:由于社会逐步进入老龄化阶段,与年龄相关的疾病也日渐成为社会的负担,其中骨质疏松是主要危害人类健康的疾病之一。近年来,骨质疏松的发病率呈逐年增高的趋势。骨质疏松症(Osteoporosis)是一种以骨量减少,骨组织微结构破坏,导致骨强度下降,骨脆性增加,发生以骨折为特征的全身性骨骼疾病。骨质疏松性骨折有较大的危害性,会导致多数患者生活不能自理,生活质量明显下降,甚至死于各种严重的并发症。现有的骨质疏松治疗药物均有一定的副作用而使其临床应用受到限制,寻找到高效低副作用的骨质疏松治疗药物变成亟待解决的问题。体内骨代谢的平衡主要是够破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成两者之间的平衡,而骨质疏松主要是由于这种平衡被打破,而且常常是由于破骨细胞形成的数量增多或者骨吸收功能增强,所以寻找有效地能够抑制破骨细胞形成或骨吸收功能的药物成为治疗骨质疏松的方法。在本课题中,我们前期的实验发现植物提取物鞣花酸能够抑制破骨细胞的分化,进而深入探究鞣花酸对骨质疏松的防治作用。鞣花酸(Ellagic acid)是存在于水果中的天然酚类抗氧化剂,包括黑莓、覆盆子等植物。之前的研究报道证实了鞣花酸具有抗增生和抗氧化、抗肿瘤、抗炎以及防治紫外线等诸多作用。但是鞣花酸在骨代谢中的作用和分子机制目前尚不清楚。本课题将通过探究鞣花酸对破骨细胞的形成和骨吸功能及其分子机制,并进一步通过构建小鼠去卵巢术后引起骨质疏松的模型,探究鞣花酸对骨质疏松症小鼠模型的骨丢失的保护作用。因此,本课题将从以上这三方面来阐述鞣花酸调控破骨细胞分化和功能分子机制,为骨质疏松以及骨溶解性疾病的药物治疗提供新的思路。实验方法:体外实验:通过从小鼠胫骨中提取出骨髓单核巨噬细胞(bone marrow macrophages,BMMs),利用cck8试剂盒测定鞣花酸对BMMs的增殖影响,并进一步通过TRAP染色探究鞣花酸对破骨细胞分化的影响。紧接着,在羟基磷灰石板种植破骨样细胞,探究鞣花酸对破骨细胞骨吸收功能的影响,并进一步通过RT-PCR定量分析鞣花酸对破骨细胞成熟标志性基因的影响。最后,利用western blot探究鞣花酸对破骨细胞分子机制的影响。体内实验:小鼠去卵巢后(OVX)骨质疏松模型:12周龄大雄性C57小鼠随机分成4组,空白对照组,假手术组,OVX+鞣花酸高剂量组,OVX+鞣花酸低剂量组,4周后收集小鼠样本,Micro-CT扫描和组织分析小鼠骨量变化,HE染色和TRAP染色观察小鼠组织学形态情况。结果:在本次研究中,我们开始通过荧光蛋白报告基因发现植物提取物鞣花酸能够抑制NF-κB转录因子的表达。在进一步的研究中,我们发现鞣花酸能够在体外实验中抑制破骨细胞的分化和骨吸收功能,并且抑制了破骨细胞成熟标志性基因的表达。我们发现鞣花酸抑制破骨细胞分化是通过抑制NF-κB和NFAT信号通路。在体内实验中,我们发现鞣花酸在小鼠去卵巢术后引起的骨质疏松模型中有着明显的防治作用。综上,这些结果都表明鞣花酸能够在体内外通过抑制破骨细胞的形成和骨吸收功能,从而对骨质疏松有着有效的防治作用。因此,鞣花酸可能成为一种潜在治疗骨质疏松的药物,并且可能能够治疗对其它与破骨细胞相关的骨溶解疾病。本课题的研究成果能为药物的临床转化和新型产品研发提供理论依据。结论:鞣花酸能够通过抑制破骨细胞的分化和骨吸收,从而保护了小鼠去卵巢后引起的骨质疏松。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

鞣花酸,破骨细胞

30igure 1. EA inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis in BMMs and osteoclast-specifxpression. (A) The cytotoxic effect of EA on BMMs at 48 hours was measured by CCsteoclastogenesis assay was used to determine the inhibitory effect of EA on the differentisteoclasts. (C) The number of TRAP (+) osteoclast-like cells were calculated. *p<0.05, ** p<0.<0.001. 1：鞣花酸抑制 RANKL 诱导的破骨细胞的形成。(A) 使用 CCK8 法测定鞣花酸对破骨前体胞毒性作用。（B）在含有 MCSF（30ng/ml）和 RANKL（50ng/ml）的完全培养基中培养，直至破骨细胞成熟，利用抗酒石酸染色法对破骨细胞进行染色，在显微镜下观察并计算的数量（细胞大于或等于 3 个细胞核定义为破骨细胞）。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.00

鞣花酸,破骨细胞,特异性基因

Figure 4. The expression of osteoclast-specific gene including DC-STAMP, CTSK, V-ATPase-d2, Acp5was measured by Real-time PCR. *p<0.05, ** p<0.005, *** p<0.001.图 4：鞣花酸抑制破骨细胞成熟标志性基因的表达。通过实时聚合酶链反应（PCR）检测破骨细胞特异性基因 DC-STAMP、CTSK、V-ATPase-D2、ACP5 的表达。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。

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