基于NIRS以及UHPLC-LTQ Orbitrap MS研究不同产地三七差异

发布时间：2020-06-25 13:55

【摘要】：目的:三七是五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根及根茎,作为驰名中外的名贵中药材,有散瘀止血、消肿止痛的功效。三七主产于云南、广西以及四川等地。道地产区为云南文山,具有较为突出的道地性。近年来商品三七种植由文山等传统产地大规模向新产区扩展,其盲目引种及扩大产区,致使药材的质量下降,中药质量直接影响着整个中医药行业的发展。目前市场上售卖的三七大多以文山三七为主,常常存在以其他产地三七冒充文山三七的现象。由于三七种植的独特性,每三年为一个周期,且需要轮流播种以保持土壤微量元素的平衡,以期避免影响三七的质量。对于三七的现行评价方法如性状鉴别、紫外分光光度法、HPLC指纹图谱等,仍存在一些不足,如辨识度不高等问题,没有一套快速、准确区分不同产地三七的技术方法。因此,探索并建立一种辨识度高且快速有效准确区分不同产地三七的方法对三七的质量控制方面具有重要的理论和实践意义,基于以上思考,本研究拟利用高效绿色的近红外光谱技术(near infrared reflectance spectroscopy,NIRS)以及超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱组合式高分辨质谱(UHPLC-LTQ Orbitrap MS)联用技术研究不同产地三七差异。皂苷类成分是三七的中药化学成分之一,具有很强的生物活性,在三七中成分含量很高,目前对于三七皂苷类成分的挖掘还有很大的空间,不同的土壤以及气候环境可能会对三七中皂苷类成分的积累产生不同的影响。针对上述问题,本研究将以皂苷类成分为侧重点开展对不同产地三七的成分分析研究。方法:从云南、广西两省收集10个不同产地三七样品,共50个批次,每个产地5个批次。采用NIRS以及UHPLC-LTQ Orbitrap MS技术分析不同产地三七。具体包括:1.应用NIRS研究不同产地三七差异:利用傅里叶变换红外光技术测定50个批次三七样品在10000-4000cm-1的光谱图,对比不同产地三七光谱图并结合具有模式识别技术的SIMCA法对10个不同产地的三七进行分析。2.应用UHPLC-LTQ Orbitrap MS技术并结合统计学方法对不同产地三七进行分析:对50个批次不同产地三七进行质谱扫描,并采用SIMCA-P13.0软件(Umetrics)进行主成分分析(principle component analysis,PCA)和正交信号校正偏最小二乘法分析(orthogonalprojection to latent structures,OPLS)分析数据,构建不同产地三七模型,并对其全成分进行多维统计分析。3.应用UHPLC-LTQ Orbitrap MS技术对三七中皂苷类成分进行全面表征:采用多种数据处理策略对三七皂苷类成分进行解析,通过常规的数据依赖性(data-dependent acquisition,DDA)采集技术根据对照品的裂解规律和特征碎片离子进行快速筛查;采用母离子列表(parent ion list,PIL)技术对未实现二级碎片检测的组分进行分析;建立12种亚型非目标性成分库进行Metworks高通量筛查;构建三七皂苷类成分特征碎片模板,在FISH Filter中进行高通量搜索。4.不同产地三七皂苷类成分差异分析:结合前期研究,分析比较不同产地三七中皂苷类成分,揭示不同产地三七的差异性皂苷类成分。使用统计学技术在有差异的组间进行皂苷类成分中检索,确定不同产地三七差异性皂苷类成分。结果:1.利用傅里叶变换红外光谱法并结合具有模式识别技术的SIMCA法对10个不同产地的三七的分析结果:10个产地三七药材的类间距均较大,表明10个产地三七分离度良好,且识别率和拒绝率都达到了 100%,即可有效区分不同产地三七。本研究所采用傅里叶变换近红外光谱法并结合具有模式识别技术的SIMCA法区分不同产地三七,该方法快速、准确、简单可靠。2.通过UHPLC-LTQ Orbitrap MS技术并结合统计学方法对不同产地三七进行多维统计分析结果:10个不同产地三七有很好的分离度,表明不同产地可引起三七相关成分发生显著变化。且所构建模的模型稳定、可靠。3.通过UHPLC-LTQ Orbitrap MS技术结合多种数据采集、挖掘策略快速分析三七中皂苷类成分的结果:在三七中共鉴定出132个化合物,其中采用常规的DDA-MS2采集方法,共鉴定了73个化合物;采用PIL-MS2、PIL-MS3方法,实现了24个未实现二级碎片检测的组分的结构鉴定,其中8个皂苷成分首次在三七药材中检出;采用非目标型数据挖掘策略,实现了35个未见报道化合物的结构鉴定。4.对有差异的组间进行差异性代谢成分比较分析结果:结果表明,三七产地文山与百色有23个变量在两组间存在显著性差异;文山与马关有25个变量在两组间存在显著性差异;文山与弥勒有28个变量在两组间存在显著性差异;文山与蒙自有23个变量在两组间存在显著性差异;文山与丘北有20个变量在两组间存在显著性差异;文山与石林有9个变量在两组间存在显著性差异;文山与石屏有20个变量在两组间存在显著性差异;文山与师宗有23个变量在两组间存在显著性差异;文山与砚山有20个变量在两组间存在显著性差异。对于人参皂苷Rb1的含量,文山产地与百色、弥勒、丘北、师宗以及砚山等五个产地存在显著性差异;三七皂苷R1的含量,文山产地明显高于其它9个产地。结论:本研究基于NIRS及UHPLC-LTQ Orbitrap MS技术构建了一套快速区分不同产地三七的分析方法。NIRS指纹图谱具有快速、准确、可靠和无损的特性,采用NIRS技术对不同产地三七进行分析。同时,基于UHPLC-LTQ Orbitrap MS技术,结合多种数据采集和挖掘策略对三七的皂苷类成分进行分析。采用上述方法,在三七中共鉴定出132个皂苷类化合物。以鉴定出的132个皂苷类化合物为基础,通过对不同产地三七的皂苷类成分进行分析,较为全面地区分出不同产地三七间的差异性皂苷类成分。本研究可为三七不同产地溯源体系的构建和优质三七质量标准的建立提供科学依据,具有良好的理论意义和实际应用价值。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284.1;O657.63

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